Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.7. Các kỹ thuật thu thập thông tin
2.7.1. Các kỹ thuật xét nghiệm
Toàn bộ các kỹ thuật liên quan tới bệnh phẩm nghi dại, vi rút sống được thực hiện trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp III của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
Mục tiêu 1 Thực trạng nguy cơ mắc bệnh dại ở người giết mổ chó - Xác định tỷ lệ nhiễm vi rút dại ở chó tại lò mổ
* Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp phát hiện kháng nguyên vi rút dại ở mô não
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được coi là kỹ thuật chuẩn vàng để chẩn đoán nhiễm vi rút dại trong các mẫu bệnh phẩm mô não[120]. Sử dụng phương pháp ép làm tiêu bản mô não, nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đơn dòng kháng vi rút dại của hãng Fujirebio Diagnostics, Malvern, PA. Các nghiên cứu đã khẳng định kháng thể kháng dại gắn huỳnh quang của Fujirebio Diagnostics, Malvern, PA có khả năng phát hiện toàn bộ các genotype của Lyssavirus hiện nay [125].
* Kỹ thuật RT – PCR xác định vật liệu di truyền của vi rút dại trên mô não Kỹ thuật RT – PCR áp dụng cho các mẫu dương tính được xác định bằng kỹ thuật FAT với hai mục đích: (i) nhằm khẳng định kết quả chẩn đoán FAT và (ii) sử dụng sản phẩm PCR để thực hiện giải trình tự gen, phân tích đặc điểm di truyền của vi rút (nếu có).
Sử dụng cặp mồi khuếch đại gen mã hóa cho nucleoprotein của vi rút dại N7 và JW6E có trình tự N7 vị trí 55 - 74 (3’ATGTAACACCTCTACAATGG5’) và JW6E vị trí 641 – 660 (3’CAGTTGGCACACATCTTGTG5’) (Bourhy, 1993 và Healton, 1999). Các nghiên cứu chỉ ra rằng các cặp mồi này có khả năng
khuếch đại gen N của vi rút dại cổ điển và các genotype khác thuộc Lyssavirus [49]. Cụ thể kỹ thuật như sau:
- Tách chiết ARN từ mô não bằng bộ sinh phẩm Rneasy Lipid Tissue – QIAGEN, Đức.
- Thực hiện phản ứng RT – PCR, sử dụng bộ sinh phẩm phẩm One step RT – PCR (QIAGEN, Đức).
- Các thành phần cho một phản ứng:
Chất phản ứng Thể tích cho một phản ứng
Nước cất 20 l
dNTPs 2 l
Dung dịch đệm phản ứng (5x Buffer) 10 l
Mồi ngược (JW6E – 10 pmol/àl) 3 l
Mồi xuụi (N7 – 10 pmol/àl) 3 l
Enzym mix 2 l
Mẫu ARN 10 l
Tổng thể tích 50 l
- Chu kỳ nhiệt: phản ứng sao chép ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50oC trong 30 phút. Tiếp đó biến tính ADN ở nhiệt độ 94oC trong 15 phút và thực hiện 35 chu kỳ nhiệt bao gồm 94oC trong 1 phút, 540C trong 1,5 phút và 720C trogn 15 phút. Cuối cùng là 720C trong 10 phút. Sản phẩm đích có độ dài 605pb.
- Xác định nồng độ kháng thể trung hòa ở chó tại lò mổ
Sử dụng kỹ thuật trung hòa giảm đám huỳnh quang nhanh (RFFIT) để xác định và định lượng kháng thể trung hòa kháng vi rút dại.
- Xác định nồng độ kháng thể trung hòa kháng vi rút dại ở người tại lò mổ
* Kỹ thuật trung hòa giảm đám huỳnh quang nhanh định lượng kháng thể trung hòa kháng vi rút dại trong huyết thanh của người và chó
Toàn bộ các mẫu huyết thanh sẽ được sàng lọc kháng thể kháng dại bằng kỹ thuật RFFIT với một nồng độ pha loãng huyết thanh là 1/10. Nếu các mẫu này gây ức chế 50% đám huỳnh quang so với mẫu vi rút chứng thì được coi là dương tính với kháng thể trung hòa kháng vi rút dại và sẽ tiếp tục được định lượng chính xác hiệu giá kháng thể kháng dại bằng kỹ thuật RFFIT được trình bày chi tiết dưới đây [35],[100],[91],[8],[78].
Kỹ thuật này được thực hiện theo thường quy chuẩn thức của tổ chức Y tế thế giới [120]. Nguyên lý và các bước chính như sau:
- Nguyên lý: Một lượng vi rút cố định được ủ với lượng tương đương huyết thanh cần thử nghiệm đã được pha loãng ở các nồng độ khác nhau.
Chứng âm là huyết thanh có nồng độ kháng thể nhỏ hơn 0,1 IU/ml và chứng dương là huyết thanh chuẩn đã biết trước nồng độ (thông thường là 0,5 IU/ml và 2 IU/ml) cũng được pha loãng ở các nồng độ và ủ với lượng vi rút cố định để làm thang chuẩn kháng thể cho mỗi thử nghiệm. Cho tế bào nhạy cảm với vi rút dại vào hỗn hợp vi rút - huyết thanh trên. Nuôi cấy tế bào trong 24 – 72 giờ, cố định và nhuộm tế bào với kháng thể kháng vi rút dại gắn huỳnh quang.
Đếm số lượng đám huỳnh quang ở mỗi nồng độ pha loãng huyết thanh cần thử nghiệm và huyết thanh chuẩn. Sử dụng công thức “Reed và Muench” để tính nồng độ giảm 50% (ED50) đám huỳnh quang ở mẫu huyết thanh thử nghiệm và mẫu huyết thanh chuẩn. Tính được nồng độ hiệu giá kháng thể trung hòa có trong huyết thanh thử nghiệm dựa trên so sánh với ED50 của huyết thanh mẫu chuẩn đã biết trước hiệu giá.
Các bước tiến hành:
- Pha huyết thanh chuẩn (2 IU/ml) và huyết thanh cần chuẩn độ bậc 5 từ 1: 5; 1: 25; 1: 125; 1: 625.
- Cho 0,1 ml/ 1 giếng huyết thanh mẫu chuẩn, huyết thanh cần chuẩn độ đã pha loãng ở các nồng độ. Mỗi nồng độ thực hiện trên 1 giếng của slide nuôi cấy tế bào 8 giếng.
- Cho 0, 1 ml/giếng vi rút thử thách chứa 50 FFD50. Ủ slide nuôi cấy tế bào ở tủ ấm 35oC, 5% CO2 trong 90 phút.
- Cho 0, 2 ml/giếng tế bào NA có nồng độ 1 x 106 /ml.
- Ủ slide ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ.
- Sau khi ủ 24 giờ, tiến hành nhuộm huỳnh quang với kháng thể đơn dòng kháng vi rút dại
- Đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang có bước sóng 450 nm, độ phóng đại 160 - 200 lần.
- Xác định log (nghịch đảo D50) huyết thanh chuẩn và huyết thanh thử nghiệm theo công thức Reed và Muench.
Log (nghịch đảo ED50) của HT cần xác định x Nồng độ kháng thể HT chuẩn Hiệu giá HT = _________________________________________________________________
Log (nghịch đảo ED50) của huyết thanh chuẩn