Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra ứng dụng nuôi cấy

4.4 Nội dung 3: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân ứng dụng nuôi cấy vi

4.4.1 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra ứng dụng nuôi cấy

4.4.1.1 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis

a) Khảo sát đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis

Hình 4. 26: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis trong môi trường thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone thương mại.

7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0 9,2 9,4

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72

Log [mật sốBacillus subtilis, CFU/mL]

Thời gian nuôi cấy (giờ)

Các môi trường dinh dưỡng:

Peptone thương mại

Peptone_Neutrase thủy phân thịt cá Peptone_Papain thủy phân thịt cá Peptone_Bromelain thủy phân thịt cá Phụ phẩm thịt dè cá tra

Ngành Công nghệ thực phẩm 103 Khoa Nông nghiệp

Qua kết quả Hình 4.26, Kết quả xử lý thống kê cho thấy rằng có sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các môi trường nuôi cấy, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (với p<0,05). Vi khuẩn B.subtilis với mật độ vi khuẩn ban đầu cho vào bình môi trường nuôi cấy là 7,15 lgCFU/mL và theo thời gian khảo sát thì mật độ của vi khuẩn tăng dần và đạt mật độ cao nhất tại thời điểm 24 giờ. Nhưng đến thời điểm 28 giờ mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis bắt đầu bước vào pha ổn định và sau 52 giờ thì mật độ giảm dần ở các thời điểm còn lại. Như vậy, theo đường cong tăng tăng trưởng của vi khuẩn B.subtilis trong các loại môi trường dinh dưỡng thịt cá, có thể nhận thấy, thời điểm ảnh hưởng quan trọng đến sự sinh trưởng phát triển và sinh sản của B.subtilis, tại thời điểm 8 giờ, đây là thời điểm vi khuẩn B.subtilis bắt đầu tăng trưởng phát triển mạnh nhất và chính là giai đoạn chuyển tiếp từ pha lag sang pha log. Kết quả nghiên cứu này tương đồng với khả năng sinh trưởng của chủng B. subtilis thời gian tăng từ 6 đến 10 giờ và mật độ tế bào ổn định trong vòng 20-35 giờ (Aspmo et al., 2005). Mật độ vi khuẩn B.subtilis tại thời điểm 24 giờ là thời điểm mà sinh khối cũng như mật độ tế bào trong các môi trường là cao nhất. Mật số tế bào vi khuẩn B.subtilis cao nhất tại thời điểm 24 giờ cho tất cả môi trường nuôi cấy: Môi trường peptone từ enzyme bromelain thủy phân protein dè cá tra>Môi trường peptone từ enzyme neutrase thủy phân protein dè cá tra >Môi trường peptone từ enzyme papain thủy phân protein dè cá tra > Môi trường peptone thương mại > Môi trường phụ phẩm dè cá tra, tương ứng 8,64±0,01 > 8,58±0,04 > 8,57±0,01 > 8,56±0,01 > 8,03±0,02 lgCFU/mL. Điều này có thể giải thích rằng, do cấu tạo hoạt động của mỗi enzyme đều khác nhau nên mức độ thủy phân cũng khác nhau. Các sản phẩm sau khi thủy phân protein chính là những acid amin và peptide, là nguồn dinh dưỡng trong nuôi cấy vi sinh vật dễ dàng hấp thu. Kết quả cho thấy các môi trường peptone thủy phân có mật số cao hơn mẫu thịt dè cá đối chứng. Môi trường thịt cá đối chứng chưa qua quá trình thủy phân bằng enzyme, khi đem nuôi cấy B.subtilis cho mật số tế bào rất thấp do thành phần chính của thịt cá vẫn còn là những đoạn peptide dài liên kết kết peptide chặt chẽ nên vi sinh vật khó có thể hập thụ chất dinh dưỡng được.

Qua các môi trường nuôi cấy nuôi cấy B.subtilis cho thấy môi trường peptone từ enzyme bromelain thủy phân protein dè cá tra có mật độ tế bào cao cao hơn so với các môi trường còn lại. Do vậy có thể chon môi trường peptone từ enzyme bromelain thủy phân protein thịt dè cá tra ứng dung nuôi cấy vi khuẩn B.subtilis.

Ngành Công nghệ thực phẩm 104 Khoa Nông nghiệp

b) Khảo sát khả năng sinh protease của Bacillus subtilis

Hình 4. 27: Hoạt tính protease của vi khuẩn B.subtilis trong các môi trường dinh dưỡng thịt dè và môi trường peptone thương mại

Dựa vào kết quả Hình 4.27 cho thấy hầu hết các môi trường nghiên cứu nuôi cấy B.subtilis có hoạt độ protease biến đổi theo thời gian, hoạt độ này tăng nhanh từ 8 giờ đến 16 giờ nuôi cấy và đạt cao nhất tại thời điểm 16 giờ.

Môi trường peptone từ enzyme bromelain thủy phân protein dè cá tra có hoạt tính cực đại là 0,273±0,04 AU/ml cao hơn môi trường peptone từ enzyme papain thủy phân protein dè cá tra, môi trường peptone từ enzyme neutrase thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone peptone thương mạivới hoạt độ protease lần lượt tương ứng là 0,227±0,05 AU/ml; 0,221±0,04 AU/ml;

0,144±0,01 và môi trường có hoạt tính yếu nhất là môi trường TM 0,016±0,01 AU/ml. Hoạt tính môi trường thịt cá đối chứng so với môi trường peptone từ enzyme bromelain thủy phân protein dè cá tra cao gấp 17,1 lần trong cùng thời điểm 16 giờ nuôi cấy. Kết quả cho thấy, vi khuẩn B.subtilis nuôi cấy trong môi trường thịt dè cá thủy phân bằng enzyme bromelain cho hoạt độ protease ở thời gian 16 giờ nuôi cấy thì hoạt độ protease cao hơn so với các môi trường khác. Sau thời gian nuôi cấy 16 giờ thì vi khuẩn B.subtilis hoạt tính bắt đầu giảm dần, điều này có thể là do vi khuẩn B.subtilis tận dụng nguồn dinh dưỡng cho việc sinh sản, vi khuẩn B.subtilis tăng số lượng sinh khối và sản sinh ra hoạt tính giảm dần.

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45

4 8 12 16 20 24

Hoạt tính protease (AU/mL)

Thời gian nuôi cấy (giờ) Các môi trường dinh dưỡng:

Peptone thương mại

Peptone_Neutrase thủy phân thịt cá Peptone_Papain thủy phân thịt cá Peptone_Bromelain thủy phân thịt cá Phụ phẩm thịt dè cá tra

Ngành Công nghệ thực phẩm 105 Khoa Nông nghiệp

4.4.1.2 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae

a) Khảo sát đường cong sinh trưởng của Aspergillus oryzae

Hình 4. 28: Đường cong tăng trưởng của Aspergillus oryzae trong các môi trường thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone thương mại.

Kết quả cho thấy, thời gian nuôi cấy khác nhau thì sinh khối tế bào thay đổi khác nhau. Sự khác nhau đều có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức p<0,05 (Phụ lục B). Nấm mốc Aspergillus oryzae với mật độ vi khuẩn ban đầu cho vào bình môi trường nuôi cấy là 6,9 lgCFU/mL. Trong khoảng thời gian từ 8- 24 giờ sinh khối tế bào đều tăng nhưng tốc độ chậm. Điều này có thể giải thích là do giai đoạn đầu nấm mốc Aspergillus oryzae chưa quen với môi trường dinh dưỡng, làm cho sự sinh trưởng và phát triển diễn ra chậm. Trong giai đoạn này, quá trình tổng hợp các chất để xây dựng tế bào nên chỉ tăng về kích thước và thể tích. Sinh khối tế bào tiếp tục tăng và tăng mạnh do nấm mốc Aspergillus oryzae thích ứng với môi trường dinh dưỡng và đạt giá trị cao nhất trong khoảng 48-60 giờ, và giảm dần đến 72 giờ do môi trường cạn kiệt nguồn dinh dưỡng làm giảm hoạt tính trao đổi chất, phân hủy dần các chất dự trữ và sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất. Như vậy, thời gian có ảnh hưởng lớn đến quá trình sản xuất sinh khối tế bào, thời gian nuôi cấy tăng thì sinh khối tế bào tăng nhanh và đạt giá trị cực đại, ổn định một thời gian rồi sau đó giảm dần (Hình 4.28).

6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 11,5

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72

Log [mật sốAspergillus oryzae, CFU/mL]

Thời gian nuôi cấy (giờ) Các môi trường dinh dưỡng:

Peptone thương mại

Peptone_Bromelain thủy phân thịt cá Peptone_Papain thủy phân thịt cá Peptone_Neutrase thủy phân thịt cá Phụ phẩm thịt dè cá tra

Ngành Công nghệ thực phẩm 106 Khoa Nông nghiệp

b) Khảo sát khả năng sinh protease của Aspergillus oryzae

Hình 4. 29: Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae trong các môi trường thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone thương mại

Qua hình 4.29 cho thấy hoạt tính enzyme protease giữa các khoảng thời gian nuôi cấy khác biệt có ý nghĩa (p<0,05). Hoạt tính enzyme protease tăng nhanh từ giai đoạn từ 4 – 16 giờ và đạt giá trị trung bình cao nhất ở 16 giờ khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các mốc thời gian khác. Môi trường peptone từ enzyme bromelain thủy phân protein dè cá tra có hoạt tính cực đại là 0,328±0,00 AU/ml cao hơn môi trường peptone từ enzyme papain thủy phân protein dè cá tra, môi trường peptone từ enzyme neutrase thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone peptone thương mại với hoạt độ protease lần lượt tương ứng là 0,29±0,03 AU/ml; 0,265±0,00 AU/ml;

0,245±0,01 và môi trường có hoạt tính yếu nhất là môi trường dè cá đối chứng 0,181±0,02 AU/mL. Môi trường peptone từ enzyme bromelain thủy phân protein dè cá tra trong giai đoạn từ 16-24 giờ hoạt tính enzyme giảm dần từ 0,328AU/ml xuống còn 0,268 AU/ml. Điều này có thể lý giải rằng thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae. Hoạt tính enzyme tăng nhanh chóng ở giai đoạn đầu (4-16 giờ) do nấm mốc không sinh trưởng ngay. Ngược lại tổng hợp mạnh các enzyme để sử dụng các chất dinh dưỡng mới trong môi trường (Kiều Hữu Ảnh, 2006). Sau đó dần thích nghi với điều kiện môi trường, gia tăng mật số nhanh nhưng không tổng hợp enzyme nữa. Về sau do nguồn cơ chất bắt đầu cạn kiệt, phân hủy dần dần các chất dự trữ, nấm mốc chết dần nên hoạt tính

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45

4 8 12 16 20 24

Hoạt tính protease (AU/mL)

Thời gian nuôi cấy (giờ) Các môi trường dinh dưỡng:

Peptone thương mại

Peptone_Bromelain thủy phân thịt cá Peptone_Neutrase thủy phân thịt cá Peptone_Papain thủy phân thịt cá Phụ phẩm thịt dè cá tra

Ngành Công nghệ thực phẩm 107 Khoa Nông nghiệp

enzyme bắt đầu giảm, thêm vào đó là sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất (Nguyễn Thị Hồng Lĩnh, 2011). Tóm lại, thời gian nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae tối ưu sinh tổng hợp enzyme protease có hoạt tính cao nhất là 16 giờ cho tất cả môi trường nuôi cấy.