3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân ứng dụng nuôi cấy vi
3.3.3.1 Thí nghiệm 8: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật
a) Thí nghiệm: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis
a1) Thí nghiệm: Khảo sát đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis
* Mục đích:
Theo dõi sự phát triển của Bacillus subtilis theo thời gian từ đó xác định đường cong sinh trưởng của chúng.
So sánh tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng sản xuất với dinh dưỡng thương mại
* Bố trí thí nghiệm:
Chủng Bacillus subtilis được nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp: nhân tố cố định là pH 7,0 và ở nhiệt độ phòng. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại
Nhân tố V: Các loại môi trường dùng để nuôi cấy (5 loại) V0= Protein thịt dè cá (mẫu đối chứng)
V1 = Pepton thương mại
V2 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme bromelin V3 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme papain V4 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme neutrate Tổng số nghiệm thức là 5
Tổng số mẫu thí nghiệm: 5×3 (lần lặp lại) = 15 mẫu
* Tiến hành thí nghiệm:
Chủng vi khuẩn B.subtilis được tăng sinh, pha loãng và cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau với mật độ ban đầu trong bình môi trường là 7,15 lg CFU/ml. Sau đó tiến hành khảo sát sự tăng trưởng của B.subtilis từ thời điểm 0 giờ đến 72 giờ. Sau mỗi 4 giờ tiến hành thu mẫu và khảo sát chỉ tiêu mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
*Chỉ tiêu theo dõi: Tốc độ sinh trưởng của nấm mốc B.subtilis trong các môi trường pepton khác nhau. Đồng thời, xác định môi trường thích hợp để nấm mốc B.subtilis có tốc độ sinh trưởng cao nhất.
a2) Thí nghiệm: Khảo sát khả năng sinh protease của Bacillus subtilis
* Mục đích: Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn Bacillus subtilis. Đồng thời, khảo sát môi trường thích hợp để trích ly enzyme protease từ sinh khối Bacillus subtilis có hoạt tính cao.
* Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố W: Các loại môi trường dùng để nuôi cấy (5 loại)
W 0= Protein thịt dè cá (mẫu đối chứng) W 1 = Pepton thương mại
W 2 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme bromelin W 3 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme papain W 4 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme neutrate
Tổng số nghiệm thức là: 5
Tổng số mẫu của thí nghiệm là: 5 x 3 = 15 mẫu.
* Tiến hành thí nghiệm: Mỗi bình tam giác chứa 20 mL môi trường nuôi cấy lỏng, được khử trùng ở 121oC trong 15 phút và để nguội khoảng 40 – 500C.
Sau đó cấy 5% dịch vi khuẩn đã tăng sinh 24 giờ vào năm loại môi trường nuôi cấy trên. Tiến hành nuôi mẫu trên máy lắc, sau mỗi 0 giờ, 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ tiến hành lấy mẫu thu enzyme thô để đo hoạt độ protease.
* Chỉ tiêu theo dõi: Xác định protease sinh ra.
b) Thí nghiệm: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae
b1) Thí nghiệm: Khảo sát đường cong sinh trưởng của Aspergillus oryzae
* Mục đích: So sánh tốc độ sinh trưởng của nấm mốc Aspergillus oryzae trong môi trường nuôi cấy có chứa chế phẩm protein thủy phân với môi trường chứa chế phẩm protein thủy phân thương mại.
Xác định môi trường thích hợp để nấm mốc Aspergillus oryzae có tốc độ sinh trưởng cao nhất.
* Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố X: Các loại môi trường (5 loại)
X0= Protein thịt dè cá (mẫu đối chứng) X1 = Pepton thương mại
X2 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme bromelin X3 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme papain X4 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme neutrate Tổng số nghiệm thức là 5
Tổng số mẫu thí nghiệm: 5×3 (lần lặp lại) = 15 mẫu
*Tiến hành thí nghiệm: Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau với mật độ ban đầu trong bình môi trường là 6,9 lgCFU/mL. Sau đó tiến hành khảo sát sự tăng trưởng của Aspergillus oryzae từ thời điểm 0 giờ đến 72 giờ. Sau mỗi 4 giờ tiến hành thu mẫu và khảo sát chỉ tiêu mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
*Chỉ tiêu theo dõi: Tốc độ sinh trưởng của nấm mốc Aspergillus oryzae trong các môi trường pepton khác nhau. Đồng thời, xác định môi trường thích hợp để nấm mốc Aspergillus oryzae có tốc độ sinh trưởng cao nhất.
b2) Thí nghiệm: Khảo sát khả năng sinh protease của Aspergillus oryzae
* Mục đích: Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồng thời, khảo sát môi trường thích hợp để trích ly enzyme protease từ sinh khối nấm mốc có hoạt tính cao.
* Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại
Nhân tố Y: Các loại môi trường (5 loại)
Y0= Protein thịt dè cá (mẫu đối chứng)
Y1 = Pepton thương mại
Y2 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme bromelin Y3 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme papain Y4 = Protein thịt cá thủy phân bằng enzyme neutrate Tổng số nghiệm thức là 5
Tổng số mẫu thí nghiệm: 5×3 (lần lặp lại) = 15 mẫu
* Tiến hành thí nghiệm: Mỗi bình tam giác chứa 20 mL môi trường nuôi
cấy lỏng, pH 6,5, được khử trùng ở 121oC trong 15 phút và để nguội khoảng 40 – 500C. Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau với mật độ ban đầu trong bình môi trường là 6,9 lgCFU/mL. Nấm mốc Aspergillus oryzae nuôi trên máy lắc, sau mỗi 0 giờ, 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ tiến hành lấy mẫu thu enzyme thô để đo hoạt độ protease.
* Chỉ tiêu theo dõi: Xác định protease sinh ra