4.2 Nội dung 1: Nghiên cứu thủy phân phụ phẩm thịt dè cá tra
4.2.2 Xác định các thông số động học v max và k m thủy phân thịt dè cá bằng 3
Khi nghiên cứu động học phản ứng của enzyme, nồng độ cơ chất [S] rất lớn so với hằng số phân ly biểu kiến của phức enzyme-cơ chất km, vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc nồng độ cơ chất (Lê Ngọc Tú và cvt., 2002). Mỗi enzyme đều có ái lực và vận tốc thủy phân cực đại tương ứng đối với từng loại cơ chất khác nhau, vì vậy để xác định được cơ chất và nồng độ tối ưu cần khảo sát động học đối với enzyme để xác định thông số vận tốc phản ứng cực đại (vmax) và hằng số tốc độ phản ứng (km). Từ vmax và km của enzyme xác định được nồng độ tối ưu của enzyme và nồng độ cơ chất được thể hiện thông qua đồ thị Michaelis - Menten.
Khối lượng ba enzyme bromelain, papain, neutrase lần lượt tương ứng là 1,5 mg, 1 mg và 0,5 mg (hoạt độ 4,428 UI/mL), tăng dần khối lượng cơ chất thịt dè cá tra đã tách béo trong thể tích cố định 10 mL dung dịch đệm phosphate ở pH và nhiệt độ tối ưu tương ứng của từng enzyme. Dựa vào vận
tốc thủy phân của các enzyme theo hàm lượng tyrosine sinh ra và nồng độ cơ chất thủy phân, sử dụng phần mềm SAS 9.1.3 Portable, xác định được vận tốc thủy phân cực đại vmax, hằng số tốc độ km của các enzyme bromelain, papain và neutrase được thể hiện ở Bảng 4.4 với độ tin cậy R2 lần lượt là 0,9978;
0,9953; 0,998.
Bảng 4.4Thông số động học của các enzyme Enzyme
Bromelain Papain Neutrase
Kết quả cho thấy rằng hằng số phân ly km của enzyme bromelain (km = 0,0106)< papain (km = 0,0121)< neutrase (km = 0,0143), vận tốc phản ứng của enzyme bromelain > papain > neutrase, lần lượt tương ứng là 1,2746 > 1,0421
> 0,7639. Hằng số tốc độ phản ứng km còn được gọi là hằng số Michaelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme. Hằng số km đặc trưng cho ái lực của enzyme đối với cơ chất, km càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác đạt giá trị vmax càng nhanh, phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hà Thị Thụy Vy, (2018) enzyme protease nội tại từ thịt đầu tụm thẻ cú giỏ trị km 0,0795 g/mL và vmax 11,70 àM/phỳt. Cỏc giá trị này cho thấy enzyme trong nội tại thịt đầu của tôm thẻ cao hơn so với giá trị động học km của 3 enzyme bromelain, papain và neutrase. Qua đó cho thấy, km càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn và ngược lại.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu hằng số km của enzyme bromelain ở các cơ chất khác nhau azocasein 0,037, azoalbumin 0,026, casein 0,0138, sodium caseinate 0,088 và haemoglobin 0,165 mM thì cho hằng số km khác nhau (Corzob et al., 2012) và của enzyme papain trên cơ chất albumin được xỏc định là 0,165 àM (Zucker et al., 1985). Qua kết quả cho thấy nồng độ cơ chất ảnh hưởng hoạt tính 3 enzyme protease, nhưng khi nồng độ cơ chất tăng đến mức độ cao nhất thì không tăng nữa; các thông số động học enzyme phụ thuộc loại enzyme và nồng độ, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu (Banu et al., 2010; Murray et al., 1990).
Hình 4.1: Đồ thị thể hiện vmax và km của enzyme bromelain trên thịt dè cá tra
Hình 4.2: Đồ thị thể hiện vmax và km của enzyme papain trên thịt dè cá tra
Hình 4.3: Đồ thị thể hiện vmax và km của enzyme neutrase trên thịt dè cá tra Theo kết quả nghiên cứu hằng số tốc độ km giữa các enzyme trên cùng cơ chất phụ phẩm cá tra đã tách béo cho kết quả khác nhau, đồng thời giá trị vmax
của cùng 3 loại enzyme này trên cơ chất thịt phụ phẩm thịt dè cá tra đã tách béo cho kết quả vận tốc phản ứng cao hơn trên cơ chất thịt dè cá tra chưa tách béo, dè cá chưa tách béo có kết quả vận tốc phản ứng enzyme bromelain, papain và neutrase tương ứng là 0,634, 0,345, 0,203 àM tyrosine/phỳt (Tạ Hùng Cường, 2014). Do vậy, quá trình thủy phân được thuận lợi cần loại lipit ra khỏi cơ chất thịt dè cá tra.
Từ kết quả trên cho thấy, động học enzyme bromelain có vmax lớn hơn so với enzyme papain và enzyme neutrase. Enzyme neutrase có km cao hơn papain và enzyme bromelain. Trên cùng cơ chất thịt phụ phẩm thịt dè cá tra thì vmax của enzyme neutrase là thấp hơn enzyme papain và bromelain. Bên cạnh đó vmax của các enzyme bị ảnh hưởng bởi hàm lượng lipit có trong cơ chất thủy phân thịt dè cá tra, hàm lượng chất lipit càng thấp thì tốc độ phản ứng sẽ tăng vmax. Ngược lại, hàm hàm lượng lipit trong thịt dè cao làm cản trở quá trình thủy phân.
Dựa vào đồ thị hình 4.1, 4.2, 4.3 cho thấy: enzyme bromelain, papain và neutrase đạt đến tốc độ phản ứng cực đại ở mức cơ chất 0,78 g protein. Do vậy, tỷ lệ khối lượng enzyme/cơ chất được chọn cho thí nghiệm tiếp theo đối với bromalain 1,5 mg enzyme/0,78 g protein, papain 1,0 mg enzyme: 0,78 g protein và neutrase 0,5 mg enzyme: 0,78 g protein (trong 10 mL dung dịch đệm phosphate).