CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens
2.2.1.1. Phương pháp chiết tách
Chiết xuất là quá trình tách chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất lỏng khác. Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Chiết là phương pháp được thực hiện nhằm mục đích điều chế hay phân tích. Sản phẩm thu được của quá trình chiết là một dung dịch các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết. Có 3 quá trình xảy ra đồng thời trong chiết xuất là:
sự hòa tan của chất tan vào dung môi, sự khuếch tán của chất tan trong dung môi và sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật. Trong chiết xuất hợp chất thiên nhiên sẽ xảy ra một số quá trình sau: khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích,... Một số phương pháp chiết thường được sử dụng như chiết hồi lưu, chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn, phương pháp chiết có hỗ trợ của vi sóng, sóng siêu âm, chiết có sự hỗ trợ của enzyme …Trong đó, chiết sử dụng enzyme là phương pháp phổ biến nhất do có nhiều ưu điểm như dễ tiến hành, hiệu quả cao, thân thiện với môi trường và đặc biệt là không gây ảnh hưởng đến cấu trúc của chất cần nghiên cứu.
Phương pháp chiết tách polysaccharide sulfate (PS) từ hải sâm thực hiện dựa theo phương pháp được mô tả trong nghiên cứu của Phạm Đức Thịnh và
32
cộng sự [29, 76], tham khảo thêm từ các nghiên cứu của (Dong và cộng sự, 2014 [78] và Varsa Kale và cộng sự, 2013 [31]). Phương pháp chiết tách PS được tóm tắt theo sơ đồ hình 2.2. Phương pháp chiết tách PS từ hải sâm được mô tả trong nghiên cứu của Phạm Đức Thịnh và cộng sự là phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ kết hợp với enzyme papain – đây là một enzyme có tính đặc hiệu cao, rất bền khoảng hoạt động khá rộng trong điều kiện pH từ 4 đến 10 và nhiệt độ lên tới 80oC [79]; ở hải sâm, PS phân bố chủ yếu ở thành tế bào cơ thể và ở dạng proteoglycans (protein-polysaccharide), cơ chế hoạt động của enzyme papain trong quá trình chiết là tham gia các phản ứng cắt mạch và phá vỡ liên kết glucoside, liên kết giữa polysaccharide với mạch protein trong hải sâm bị phá vỡ cũng như protein trong hải sâm bị thủy phân theo thời gian dưới tác động enzyme từ đó giải phóng PS, các PS sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi chiết. Trong nghiên cứu của tác giả Phạm Đức Thịnh và cộng sự cũng đã nghiên cứu về các điều kiện chiết tối ưu với việc sử dụng enzyme để có thể đảm bảo được hoạt tính của enzyme, giúp hỗ trợ hiệu quả cho quá trình chiết PS từ hải sâm và đưa ra được quy trình chiết với những điều kiện đã tối ưu. Bên cạnh đó, phương pháp chiết tách bằng dung môi hữu cơ có kết hợp với enzyme papain là một phương pháp phổ biến được các tác giả sử dụng trong nghiên cứu về PS từ hải sâm nói riêng hay các sinh vật biển khác nói chung, bởi vì tính đặc hiệu của enzyme papain đối với quá trình phá vỡ liên kết của protein và polysaccharide, để tránh làm ảnh hưởng đến cấu trúc của polysaccharide, điều này dẫn đến đảm bảo hoạt tính sinh học của PS đang nghiên cứu [31, 37, 69, 78, 80].
33
Hình 2.2. Quy trình chiết tách thu polysaccharide sulfate dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens.
34
Quá trình chiết tách được tiến hành như sau: mẫu hải sâm S. horrens được làm sạch, loại bỏ nội tạng và được làm khô; sau đó mẫu hải sâm khô được chiết trong đệm acetate 0,1M (pH 6) với tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:30 (g:ml), bổ sung vào dung dịch đệm chiết enzyme papain (2000 UI/g), với tỉ lệ 10% (so với khối lượng mẫu khô), 5 mM EDTA và 5 mM L-cystein. Quá trình chiết được thực hiện ở 55 ºC. Sau 24 giờ, tiến hành lọc rồi ly tâm 6000 vòng/phút thu dịch chiết, đun sôi dịch chiết trong 10-15 phút để bất hoạt enzyme. Dung dịch Cetavlon 10% được bổ sung vào dịch chiết để kết tủa PS trong 24 giờ ở 4 ºC và sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút, thu kết tủa. Hỗn hợp kết tủa Cetavlon và PS được hòa tan trong hỗn hợp (NaCl 3M + ethanol 20%), tiếp đó, ethanol 96% được thêm vào đến nồng độ ethanol cuối cùng đạt 80% để kết tủa lại PS trong dịch tủa. Sau 24 giờ, ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút thu tủa, tủa được rửa với ethanol 75% từ 3 đến 5 lần để loại muối, sau đó sấy khô, nghiền nhỏ thu được PS dạng thô.
2.2.1.2. Phương pháp tách phân đoạn
PS từ hải sâm, được tiến hành tách phân đoạn bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-Macro Prep.
• Chuẩn bị dung dịch mẫu PS: 500 (mg) PS dạng thô, được hòa tan hoàn toàn trong 50 ml dung dịch đệm acetate 0,1 M (pH 5). Sau đó, ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 20 phút, để loại bỏ cặn, trước khi nạp lên cột sắc ký trao đổi anion DEAE-Macro Prep (1,6 x 40 cm).
• Hoạt hóa và cân bằng cột bằng dung dịch đệm acetate 0,1M (pH=5).
Tiến hành tách phân đoạn: đầu tiên, mẫu đã được chuẩn bị được đưa lên cột, sau đó dung dịch đệm acetate 0,1M (pH 5) không chứa muối NaCl, được bơm qua cột đến khi dung dịch đầu ra, có kết quả âm tính với thuốc thử phenol/acid sulfuric. Tiếp sau đó, rửa giải các các hợp chất liên kết trên cột bằng dung dịch đệm acetate 0,1M (pH 5) chứa NaCl, với nồng độ tăng dần từ 0 đến 2M, tốc độ rửa giải 0,8 ml/phút và tiến hành thu các phân đoạn với thể tích mỗi phân đoạn là 10 ml.
35
Xác định tổng carbohydrate của tất cả các phân đoạn thu nhận. Các phân đoạn thu nhận được tiến hành cô đặc để giảm thể tích, sau đó thẩm tách để loại muối, cuối cùng thực hiện quy trình đông khô thu được bột PS dạng tinh chế.
Quy trình tách phân đoạn và tinh sạch PS từ hải sâm S. horrens được tóm tắt theo sơ đồ hình 2.3 [29, 76].
Hình 2.3. Quy trình tinh sạch polysaccharide sulfate bằng kỹ thuật sắc kí trao đổi anion trên nhựa DEAE Macro-prep.
36