3.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE CÓ NGUỒN GỐC TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS
3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Với phổ hồng ngoại IR, chỉ đo các thay đổi của mômen lưỡng cực trong một phân tử; do đó, chỉ giúp ta xác định được các loại dao đặc trưng của các liên kết hay nhóm chức có trong phân tử. Vậy nên phải sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR là 1H-NMR và 13C-NMR, để có thể giải đoán, phân tích được cấu trúc của hợp chất đang nghiên cứu. Hình 3.6 thể hiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của hai phân đoạn F1 (FCS1) và F2 (FS2) từ hải sâm S. horrens; trên phổ đồ xuất hiện nhiều vùng đặc trưng của hai nhóm hợp chất Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS) và Fucan Sulfate (FS). Liên hệ tham khảo dữ liệu phổ thu được, với các nghiên cứu về cấu trúc của hai nhóm hợp chất FCS và FS, có nguồn gốc từ các loài hải sâm khác nhau trên thế giới đã được công bố [16, 37, 90, 95, 97, 98], với phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1H-NMR của hai phân đoạn F1(FCS1) và F2 (FS2), khá phức tạp với nhiều vùng tín hiệu khác nhau cùng với đó là sự chồng chập, trùng lặp nhau của các tín hiệu, độ phân giải khá kém, với phân đoạn F1 (FCS1) do trong thành phần cấu trúc, có chứa đồng thời các gốc đơn vị đường đơn khác nhau, và mật độ sulfate hóa lẫn kiểu liên kết O-glycoside khác nhau, trong cả hai phân đoạn thu được là nguyên nhân gây ra sự phức tạp này. Chúng ta chỉ có thể giải đoán phổ, dựa vào các vùng tín hiệu đặc trưng của hai nhóm hợp chất, mà không thể giải thích được một cách chi tiết tất cả các tín hiệu trên phổ thu được. Hình 3.6 – A là phổ 1H-NMR của phân đoạn F1 (FCS1), cho ta thấy những vùng tín hiệu đặc trưng của nhóm fucosylated chondroitin sulfate (FCS), đó là các tín hiệu có cường độ mạnh của proton H-6 thuộc nhóm methyl (–CH3) vòng fucose, tại độ chuyển dịch hóa học trong vùng từ 1,0 đến 1,4 ppm [16, 93]; phổ 1H-NMR của phân đoạn F2 (FS2) hình 3.6 – B, cũng xuất hiện tín hiệu có cường độ mạnh của proton H-6 thuộc nhóm methyl (–CH3) vòng fucose tại độ chuyển dịch hóa học này. Vùng tín hiệu từ 2,0 đến 3,0 là sự hiện diện nhóm acethyl của vòng GalNAc (CH3CO-), có thể khẳng định lại một lần nữa, là phân đoạn F1 thuộc nhóm fucosylated chondroitin sulfate (FCS), vì có sự hiện diện của các gốc đường đơn fucose và N-Acetyl-galactosamine trong phân đoạn này; bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR của phân đoạn F2 (FS2) hình 3.6 – B, không phát hiện thấy tín hiệu trong vùng này nên không có sự hiện diện nhóm acethyl của vòng
56
GalNAc (CH3CO-), với kết quả này cho thấy rằng, phân đoạn F2 chỉ chứa duy nhất vòng fucose, khẳng định lại là phân đoạn F2 thuộc nhóm fucan sulfate (FS). Trong vùng độ chuyển dịch hóa học từ 5,0 đến 5,8 là vùng quan sát sự hiện diện của nhóm sulfate hóa của vòng fucose. Hai tín hiệu độ chuyển dịch hóa học ở 5,67 ppm và 5,4 ppm, thể hiện tương ứng cho proton anomeric H1 của vòng pyranose với 2,4-O-disulfated fucose (Fuc2S4S) và 3,4-O-disulfated fucose (Fuc3,4S) [29]. Do đó, phân đoạn F1 (FCS1) chứa hai gốc fucose với kiểu sulfate hóa khác nhau. Tuy nhiên, nghiên cứu về nhóm hợp chất fucosylated chondroitin sulfate (FCS), có nguồn gốc từ loài hải sâm S. horrens được thu thập ở Nga, được công bố chỉ có một kiểu sulfate hóa là 2,4-O- disulfated fucose [28, 90], điều này có thể được giải thích, do sự khác biệt của phương pháp tách chiết, tách phân đoạn và do điều kiện môi trường sống khác nhau, dẫn đến sự khác nhau về thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của PS [16, 29, 90]. Vùng tín hiệu proton có độ chuyển dịch hóa học từ 3,3 đến 4,4 ppm (hình 3.6 – A), có thể là sự hiện diện các proton C2 - C5 của vòng glycosidic. Tuy nhiên, rất khó để đưa ra kết luận thông tin chính xác do sự chồng chéo của các tín hiệu [16, 29]. Các kết quả phân tích phổ NMR thu nhận được của phân đoạn F1 từ hải sâm S. horrens, tương đồng với các nghiên cứu đã công bố trước đây, về sự fucosyl hóa chondroitin sulfate từ hai loài hải sâm Holothuria vaganbuda, Holothuria polii [16, 98], chỉ có sự khác biệt là ở mật độ nhóm sulfate và vị trí của nhóm sulfate của vòng pyranose; do đó, cấu trúc của mạch khung của phân đoạn F1 từ hải sâm S. horrens được thể hiện trong hình 3.7.
Trong phổ 1H-NMR (hình 3.6 – B) của phân đoạn F2 (FS2), xuất hiện tín hiệu với độ chuyển dịch hóa học proton anomeric (H1) ở 5,1 – 5,3 ppm, điều này phù hợp với sự tồn tại của các loại đơn vị α-L-fucose khác nhau [99].
Các tín hiệu có cường độ cao tại độ chuyển dịch hóa học 5,19 ppm, tương ứng với gốc 4-O-sulfated-Fucose (Fuc4S) và các tín hiệu khác yếu hơn ở vùng tín hiệu có độ chuyển dịch hóa học từ 5,3 đến 5,4 ppm được xác định là gốc 2-O- sulfated-Fucose (Fuc2S) [91, 99], kết quả này cũng được xác nhận bởi kết quả của phổ hồng ngoại IR cho phân đoạn F2 (FS2). So sánh đối chiếu với các nghiên cứu về nhóm hợp chất fucan sulfate (FS), từ nguồn gốc các loài hải sâm,
57
của các tác giả trên thế giới đã được công bố trước đây [16, 88, 89, 99], chỉ ra rằng cấu trúc nhóm hợp chất fucan sulfate (FS), của hải sâm được hình thành từ các kiểu sulfate hóa lên gốc fucose khác nhau. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của tác giả Ustyuzhanina và cộng sự, 2018 [28, 90], đã công bố nhóm hợp chất fucan sulfate được tách chiết phân đoạn từ loài hải sâm S. horrens ở Nga, chỉ chứa một kiểu sulfate hóa lên gốc fucose (Fuc2S); điều này một lần nữa khẳng định, điều kiện môi trường sống khác nhau dẫn đến sự khác nhau về thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của PS, tạo nên đặc điểm cấu trúc của các nhóm hợp chất PS vô cùng phong phú và đa dạng.
Hình 3.6. Phổ 1H-NMR các phân đoạn F1 (A) và F2 (B) của PS ở hải sâm Stichopus horrens
58
Hình 3.8 thể hiện kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C- NMR của phân đoạn F2 (FS2), cũng xuất hiện các vùng tín hiệu đặc trưng của nhóm hợp chất fucan sulfate; phổ đồ cho thấy rằng, các tín hiệu xuất hiện trong vùng có độ chuyển dịch hóa học từ 90 đến 100 ppm, là các tín hiệu đặc trưng cho nhóm methyl của carbon anomeric (C1) và tín hiệu tại độ chuyển dịch hóa học ở 16,00 ppm là tín hiệu đặc trưng cho carbon C6 của nhóm methyl (Fuc- CH3) của vòng fucose [88, 96]. Đồng thời, trong phổ 13C-NMR hình 3.8 và trong phổ 1H-NMR hình 3.6 – B, cũng xuất hiện tương ứng một số các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học ở 92,81 ppm (C1), 5,4 ppm (H1); các tín hiệu này thể hiện sự hiện diện của đơn vị (1→3)-linked α-Fuc2S và tại các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học ở 96,84 ppm (C1), 5,19 (H1); các tín hiệu này thể hiện sự hiện diện của đơn vị (1→3)-linked α-Fuc4S [33]. Các tín hiệu xuất hiện trong vùng từ 65 đến 75 ppm, cho thấy sự xuất hiện các carbon C2-C5 của vòng fucose, kết quả này tương tự được đưa ra trong nghiên cứu của tác giả Ustyuzhanina và cộng sự, 2018 [28, 90], đã công bố về nhóm hợp chất fucan sulfate được tách chiết phân đoạn từ loài hải sâm S. horrens ở Nga [28, 90].
Dựa vào các kết quả phân tích phổ NMR của phân đoạn F2 (FS2), cấu trúc của mạch khung của phân đoạn F2 từ hải sâm S. horrens được thể hiện trong hình 3.9.
Hình 3.7. Cấu trúc của phân đoạn F1 (FCS1) của PS ở hải sâm Stichopus horrens
59
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR phân đoạn F2 của PS ở hải sâm Stichopus horrens
Hình 3.9. Cấu trúc của phân đoạn F2 (FS2) của PS ở hải sâm Stichopus horrens
60
Tổng kết lại: Từ mẫu hải sâm S. horrens tươi được xử lý sơ bộ và sử dụng các phương pháp tách chiết thu được mẫu polysaccharide sulfate (PS) dạng thô; sử dụng kỹ thuật sắc kí trao đổi anion với cột tách DEAE – Macro Prep (1,6 x 40 cm), để tách phân đoạn đã phân lập được hai phân đoạn thuộc hai nhóm hợp chất từ hải sâm S. horrens F1- fucosylated chondroitin sulfate (FCS1) và F2-fucan sulfate (FS2), tiến hành phân tích thành phần hóa học của hai phân đoạn, kết quả cho thấy cả hai phân đoạn đều chứa hàm lượng sulfate rất cao tương ứng là 47,4 % và 48,1 %, mặc dù hàm lượng carbohydrate khá thấp. Sử dụng các phương pháp phân tích phổ hồng ngoại IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, kết hợp kết quả thu được từ hai phương pháp tiến hành phân tích cấu trúc cho thấy, mang đặc điểm đặc trưng cho từng nhóm hợp chất, kiểu sulfate hóa đa dạng ở các vị trí khác nhau của vòng pyranose đối với FCS và vòng fucose đối với FS. Theo các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và ứng dụng của PS cho thấy, với thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của hai phân đoạn thuộc hai nhóm hợp chất F1-fucosylated chondroitin sulfate (FCS1) và F2-fucan sulfate (FS2) có nguồn gốc từ hải sâm S. horrens có thể dự đoán tiềm năng khả quan về hoạt tính sinh học quý và có thể ứng dụng trong các lĩnh vực.
Thực hiện nghiên cứu và kết quả thu được của đề tài này sẽ là cơ sở khoa học rất có giá trị cho các bước nghiên cứu tiếp theo sâu hơn, rộng hơn về sự liên kết, mối quan hệ giữa các thành phần hóa học, cũng như đặc điểm cấu trúc với các hoạt tính sinh học và khả năng của các hợp chất PS từ nguồn gốc của hải sâm S. horrens.
61