3.2. QUÁ TRÌNH TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS
3.2.2. Thành phần hóa học các phân đoạn thu được của
Hai phân đoạn F1 và F2 thu được sau quá trình sắc ký được tiến hành xác định hàm lượng một số thành phần hóa học cơ bản, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3. Hàm lượng carbohydrate thu được từ hai phân đoạn có sự chênh lệch so với mẫu PS dạng thô, có thể được giải thích là do hàm lượng protein trong mẫu dạng thô chiếm tỉ lệ khá cao 14,1 % khối lượng mẫu khô, trong khi ta có thể thấy hàm lượng protein của phân đoạn F1 chỉ còn chiếm 5,01 %, còn với phân đoạn F2 đều không phát hiện thấy hàm lượng protein. Hàm lượng uronic acid của phân đoạn F1 là 4,7 % khá tương đồng với mẫu PS dạng thô;
còn với phân đoạn F2 không phát hiện thấy Uronic acid. Hàm lượng sulfate thu được của hai phân đoạn F1 và F2 lần lượt là 47,4% và 48,1 %; kết quả này cũng có sự chênh lệch giữa dạng thô và các phân đoạn, có thể giải thích cho sự chênh lệch này theo giả thuyết đã đặt ra với hàm lượng carbohydrate. Liên hệ với quá trình tách phân đoạn với kỹ thuật sắc ký trao đổi anion, bản chất pha tĩnh Macro- Prep DEAE là cơ chế trao đổi anion yếu, với các amin bậc 4 liên kết với ion Cl- , các phân đoạn của PS được rửa giải theo chế độ gradient tăng dần nồng độ của NaCl trong dung dịch rửa giải, với hai peak thu được thể hiện trong sắc kí đồ của quá trình tách phân đoạn hình 3.1 khá gần nhau cho thấy sự chênh lệch về mật độ điện tích âm không lớn, hoàn toàn phù hợp với kết quả hàm lượng sulfate khi phân tích hai phân đoạn F1 và F2, cũng cho kết quả chênh lệch không lớn, bởi vì cơ chế rửa giải là phân đoạn nào có mật độ nhóm mang điện tích âm nhỏ hơn thì liên kết với pha tĩnh yếu hơn, sẽ được rửa giải ra trước, còn với phân đoạn nào có mật độ nhóm mang điện tích âm lớn hơn sẽ được rửa giải ra sau.
49
Bảng 3.3. Thành phần hóa học của PS phân đoạn F1, F2 của hải sâm Stichopus horrens
**% tính theo khối lượng của mẫu PS của hai phân đoạn F1, F2
Như đã phân tích, để có thể giải đoán và xác định rõ cấu trúc của hai phân đoạn thu được, đầu tiên cần tiến hành phân tích xác định thành phần của các gốc đường đơn (monosaccharide). Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.3, là tỷ lệ mol giữa các gốc đường của các phân đoạn thu được của PS từ hải sâm S.
horrens. Hình 3.2 thể hiện sắc kí đồ của các dung dịch chuẩn đường đơn, với 4 peak trên sắc kí đồ tương ứng với 4 đường đơn chuẩn D-Galactose (Gal), L- Fucose (Fuc), D-Glucose (Glu), N-Acetyl-galactosamine (GalNAc), các peak tách nhau rõ ràng với độ phân giải và độ chọn lọc thích hợp cho việc định lượng các thành phần của các gốc đường đơn. Thành phần Glucuronic acid (GlcA) được xác định bằng phương pháp so màu với thuốc thử Carbazole [83].
PS
Tổng carbohydrate **%
Tỷ lệ mol giữa các gốc
đường Sulfate
**%
Uronic acid
**%
Protein
**%
Fuc GalNAc GlcA
F1 12,1 1 0,63 0,41 47,4 4,7 5,01
F2 15,1 1 - - 48,1 - -
50
Bảng 3.3 thể hiện kết quả phân tích thành phần các gốc đường đơn, và sắc kí đồ trong hình 3.3 và 3.4 của hai phân đoạn F1 và F2 từ hải sâm S. horrens cho thấy, trong phân đoạn F1 có chứa đồng thời cả 3 gốc đường là Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic acid (GlcA) với các tỉ lệ mol giữa các gốc đường này là Fuc : GalNAc : GlcA = 1 : 0,63 : 0,41; còn với phân đoạn F2 thì chỉ chứa duy nhất một gốc đường Fucose (Fuc). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả khi phân tích thành phần các gốc đường đơn của mẫu PS dạng thô, tỷ lệ hay phần trăm khối lượng giữa các gốc đường khá tương đồng, có thể đưa ra kết luận sơ bộ là PS có nguồn gốc từ hải sâm S. horrens, chứa hai nhóm hợp chất và cấu trúc chỉ chứa 3 gốc đường đơn Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic acid (GlcA).
Hình 3.2. Sắc ký đồ IC thu được của dung dịch chuẩn của các đường đơn.
51
Dựa trên các nghiên cứu về PS từ hải sâm trên thế giới, các phân đoạn có thành phần đường đơn (monosaccharide) bao gồm Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic acid (GlcA) và sulfate được xếp vào nhóm Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS), còn những phân đoạn có thành
Hình 3.3. Sắc ký đồ IC của thành phần đường đơn phân đoạn F1
Hình 3.4. Sắc ký đồ IC của thành phần đường đơn phân đoạn F2
52
phần đường đơn chỉ chứa duy nhất Fucose (Fuc) và có chứa nhóm sulfate sẽ được xếp vào nhóm Fucan Sulfate (FS) [7, 12, 28, 90]. Tuy nhiên, vẫn có nghiên cứu thì khi tách phân đoạn thu được 3 peak tương ứng với 3 phân đoạn, ví dụ như nghiên cứu của tác giả Phạm Đức Thịnh và các cộng sự về loài hải sâm Stichopus variegatus [76], sau khi chiết tách phân đoạn thì thu nhận được ba phân đoạn F1, F2, F3 với phân đoạn F1 có chứa năm gốc đường Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc), Glucuronic acid (GlcA), Galactose (Gla), Glucose (Glu), trong đó Galactose (Gla), Glucose (Glu) chỉ chiếm lượng rất thấp và sulfate; phân đoạn F2 có chứa ba gốc đường Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc), Glucuronic acid (GlcA) và sulfate; còn với phân đoạn F3 chỉ chứa duy nhất một gốc đường Fucose (Fuc), và sulfate; tác giả đã xếp các phân đoạn F1 và F2 vào nhóm Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS) và phân đoạn F3 sẽ thuộc nhóm Fucan Sulfate (FS). Do vậy, để có thể phân biệt và chứng minh, các đặc điểm từ kết quả phân tích thành phần các phân đoạn thu nhận sẽ thuộc nhóm nào ta có thể phân tích như sau: hàm lượng uronic acid được chứng minh có mặt trong tất cả các phân đoạn của nhóm FCS [7], với phân đoạn thuộc nhóm FCS thì ngoài 3 gốc đường chính là Fucose (Fuc), N- Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic acid (GlcA) thì các gốc đường Galactose (Gla) và Glucose (Glu) cũng được phát hiện với hàm lượng rất thấp.
Dựa vào cơ chế trao đổi anion yếu của quá trình tách phân đoạn PS từ hải sâm, thì hàm lượng sulfate của các phân đoạn có sự thay đổi tuyến tính tăng dần theo nồng độ của NaCl trong dung dịch rửa giải, điều này đã được giải thích ở lập luận trên, phân đoạn được rửa giải ở nồng độ NaCl càng cao thì sẽ cho ra phân đoạn chứa hàm lượng sulfate cao hơn so với các phân đoạn trước đó.
Tóm tắt lại, PS ở loài hải sâm S. horrens sau khi tách phân đoạn bằng kỹ thuật sắc kí trao đổi anion thu được hai phân đoạn. Từ kết quả về các thành phần hóa học như hàm lượng carbohydrate, tỷ lệ các gốc đường đơn, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic acid và protein, đồng thời dựa vào các nghiên cứu khác về PS ở các loài hải sâm trên thế giới, thì phân đoạn F1 được xếp vào nhóm Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS) và phân đoạn F2 được xếp vào nhóm Fucan Sulfate (FS) [8, 23, 27, 29, 37, 77, 94].
53