CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3. Các phương pháp phân tích phổ về cấu trúc của polysaccharide
2.2.3.1. Phương pháp phổ hồng ngoại IR
Phương pháp phân tích theo quang phổ hồng ngoại là một trong những kỹ thuật phân tích rất hiệu quả. Quang phổ hồng ngoại có thể được sử dụng trong xác định và nghiên cứu cấu trúc, cho biết sự hiện diện của các nhóm chức trong các hợp chất. Một trong những ưu điểm của phương pháp phổ hồng ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng hưởng từ điện tử…), đó là cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi nhiều phương pháp tính toán phức tạp. Việc phân tích cấu trúc của PS, với đặc trưng là các mô hình sulfate hóa trên khung mạch chính, nên dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại thu được mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate, trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (bảng 2.1). Khi nhóm sulfate ở vị trí axial ta chỉ có một vị trí là C4, còn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3, vậy nên muốn biết chính xác cần phải tiến hành phân tích dựa vào phổ NMR, để xác định rõ các vị trí của các nhóm sulfate trong cấu trúc của PS đang nghiên cứu.
39
Bảng 2.1. Các đỉnh phổ, vùng phổ đặc trưng của fucoidan xuất hiện trên phổ hồng ngoại (IR) [70, 86]
Đỉnh Dao động
775 Dao động dãn vòng của α- anomer
802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6 822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí
equatorial
845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial 847 Dao động của liên kết C1-H của α- anomer
893 Dao động của liên kết C1-H của β- anomer 917 Dao động vòng của α - anomer
1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal 1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C 1255-1264 Dao động hoá trị của S=O
1420 Dao động hoá trị đối xứng của COO 1430 Dao động gấp của C-H
1730 Dao động hoá trị của C=O 3300-3440 Dao động hoá trị của O-H
Tiến hành: Mẫu các phân đoạn PS được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR của PS được ghi trên máy TENSOR 27 - Bruker (Đức) đo tại Viện công nghệ hóa học, số 01 Mạc Đĩnh Chi, Tp. Hồ Chí Minh, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong
40
vùng số sóng 4.000 - 400 cm-1. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1 ta có thể xác định được các nhóm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí axial hay equatorial [70, 87, 88].
2.2.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Để có thể xác định được cấu trúc của một hợp chất, phải kết hợp tối thiểu là giữa phổ IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), trong đó phổ NMR cung cấp nhiều thông tin về vị trí nhóm thế, vị trí liên kết, để có thể giải đoán được cấu trúc của hợp chất nghiên cứu; trên phổ đồ tại vị trí, mà hạt nhân hấp thu năng lượng để có hiện tượng cộng hưởng gọi là độ chuyển dịch hóa học ( δ ). Độ chuyển dịch hóa học của hạt nhân proton 1H, được ký hiệu là δH, δH, thường nằm trong khoảng từ 0 đến 20 ppm. Độ chuyển dịch hóa học của hạt nhân carbon 13C, được ký hiệu là δC, δC, thường nằm trong khoảng 0 đến 240 ppm. Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H của carbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysacaride-), có độ chuyển dịch hóa học nằm trong khoảng từ 1 - 6 ppm. Các proton 1H anomeric của mỗi monosaccharide, có độ chuyển dịch hóa học phụ thuộc vào cấu hình dạng α- hoặc β- của chúng. Hầu như các proton của α-anomeric có độ chuyển dịch hóa học xuất hiện trong vùng từ 5 - 6 ppm, còn các proton của β-anomeric có độ chuyển dịch hóa học xuất hiện ở vùng 4 - 5 ppm. PS thể hiện đặc trưng trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton thu được là dựa vào sự xuất hiện độ dịch chuyển hóa học của nhóm methyl ở vị trí C6, với tín hiệu trong vùng 1,2 – 1,4 ppm, là vùng đặc trưng H-6 của nhóm methyl; còn vị trí H-1 (H-α) của PS, có các tín hiệu độ dịch chuyển hóa học trong vùng 5,0 – 5,5 ppm. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR thể hiện nhiều đặc trưng của PS, tuy nhiên, với cấu trúc rất phức tạp của PS thì chúng ta phải sử dụng phổ 13C-NMR, để có thể giải đoán và xác định cấu trúc của PS đang nghiên cứu. Với bản chất là cường độ tín hiệu yếu hơn nhiều so với phổ
1H-NMR, tuy nhiên với ưu điểm là cho các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của các carbon trong cấu trúc một vùng rộng hơn 0 - 240 ppm so với phổ 1H-NMR;
với vùng tín hiệu δ lớn như vậy, nên các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của
13C-NMR, ít chồng chập lên nhau như trong phổ 1H-NMR. Các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của C-anomeric trong phổ 13C-NMR thường xuất hiện
41
trong vùng 90 - 100 ppm, còn với các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của C- nonanomeric xuất hiện trong vùng 60 - 85 ppm. Đối với PS, thì vùng tín hiệu đặc trưng chúng ta thường quan sát trong phổ 13C-NMR, là vùng trường cao 15-20 ppm để nhận biết tín hiệu độ chuyển dịch hóa học là của nhóm methyl – CH3 vị trí C-6 của vòng α-L-fucopyranose. Các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của carbon α-anomeric thường xuất hiện trong vùng 95 - 103 ppm, trong khi carbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng 101 - 105 ppm. Còn với nguyên tử carbon của nhóm carboxyl của uronic acid, các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học thường sẽ xuất hiện ở vùng trường thấp hơn 170 - 180 ppm. Với các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon có gắn với nhóm - OH, như C-6 của vòng pyranose và C-5 của vòng furanose, xuất hiện trong vùng trường cao hơn 60 - 64 ppm, trong khi các tín hiệu của các nguyên tử carbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng furanose), thường xuất hiện trong vùng 65 - 87 ppm. Bên cạnh, việc sử dụng phổ IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) để có thể giải đoán, phân tích xác định cấu trúc thường rất phức tạp với các mạch nhánh, chuỗi liên kết khác nhau của PS, các tác giả của các đề tài nghiên cứu thường phải sử dụng kết hợp để làm đơn giản hóa đi cấu trúc của các PS đang nghiên cứu, như bằng các phản ứng hóa học đề metyl hóa, sulfate hóa hay acetyl hóa và sử dụng kết hợp với các kỹ thuật phân tích phổ DEPT-NMR, TOCSY- NMR,… còn sử dụng cả phương pháp phân tích phổ khối lượng (MS) để phân tích cấu trúc, cùng với việc phải sử dụng các phương pháp hóa học để có thể làm tăng độ tinh khiết của các PS như các phương pháp xử lý mẫu, phương pháp chiết tách, thu nhận các phân đoạn bằng các kỹ thuật sắc kí với các cơ chế như trao đổi ion, thẩm thấu gel (loại trừ theo kích thước phân tử).
Tiến hành thực nghiệm: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C- NMR được ghi trên máy Bruker AVANCE III - 500 NMR Spectrometer (Thụy Sỹ) đo tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mẫu các phân đoạn PS được pha trong D2O với nồng độ 20 μg/ml, đo phổ 1H- NMR ở tần số 500,23 MHz và phổ 13C-NMR được đo ở 125,78 MHz với chất nội chuẩn Tetramethylsilane (TMS).
42