2.3.1. Chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử có thể hiểu đơn giản chúng như các cột mốc nằm trên trình tự DNA trong hệ gen. Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối giữa chúng phản ánh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống hay một loài trong quần thể. Chỉ thị phân tử cho phép xác định được các locus gen hay gen quy định những tính trạng của cây trồng (Chen et al., 1997). Từ những năm 1980, công nghệ chỉ thị DNA được phát hiện và áp dụng nhiều vì các chỉ thị phát hiện gen này không nhạy cảm với môi trường, được tạo ra nhiều có thể dùng để theo dõi chọn lọc hầu hết các gen quy định các tính trạng nông học quan trọng và từ đó giúp tăng đáng kể hiệu quả của chọn tạo giống cây trồng.
Chỉ thị phân tử dựa trên DNA là công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: phân loại học, chọn tạo giống thực- động vật và kỹ thuật di truyền (Jonah et al., 2011). Chỉ thị DNA không bị giới hạn về số lượng, ổn định và không chịu tác động của các yếu tố môi trường cũng như các giai đoạn phát triển của thực vật. Một chỉ thị DNA lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng. Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một chỉ thị phân tử nào có thể thỏa mãn tất cả những điều kiện trên. Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số điều kiện (Nguyễn Duy Bảy và cs., 2001).
Chỉ thị DNA có ứng dụng đặc biệt nếu thể hiện sự khác biệt giữa các cá thể cùng loài hay khác loài dựa trên khả năng phân biệt giữa đồng hợp tử và dị hợp tử bao gồm : chỉ thị đa hình và chỉ thị đơn hình. Chỉ thị đồng trội chỉ ra sự khác biệt về kích thước, ngược lại chỉ thị trội chỉ sự có mặt hay vắng mặt (Chunwongse et al., 1998). Chỉ thị DNA phân thành ba nhóm dựa vào phương
pháp phát hiện: Chỉ thị dựa trên cơ sở của phản ứng PCR, chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA và chỉ thị dựa trên những chuỗi có trình tự lặp lại (Xu et al., 1997).
2.3.1.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA
Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism- Đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn)
Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người. Trong chỉ thị RFLP, enzyme cắt giới hạn được sử dụng để cắt DNA genome thành nhiều mảnh DNA có độ dài khác nhau. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những điểm cắt giới hạn trong DNA bộ gen như đảo đoạn, thêm, mất đoạn DNA hoặc đột biến điểm tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi loài thậm chí mỗi cá thể. Mỗi loài sinh vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy các đoạn DNA được cắt ra bởi những enzyme giới hạn sẽ có kích thước khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền để xem xét các mẫu giống. Sự nhận biết các đoạn cắt được thực hiện nhờ kỹ thuật lai với các đoạn DNA với mẫu dò (Botstein et al., 1980).
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, có khả năng biểu hiện ở tất cả các allen của cùng một locus gen. Hạn chế của chỉ thị này là tốn nhiều thời gian và công sức, đòi hỏi phòng thí nghiệm với nhiều trang thiết bị kỹ thuật cao, đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn DNA mà số lượng đa hình thu được khá ít, thậm chí ở một số loài khó nhận được đa hình (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2003).
2.3.1.2. Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở tái bản DNA
Phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis đưa ra, giúp phát hiện sự đa hình DNA dựa trên cơ sở nhân bản các đoạn DNA với số lượng lớn trong ống nghiệm.
Phương pháp PCR Khái niệm
PCR là phương pháp nhân nhanh một đoạn phân tử DNA trong ống nghiệm. Đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra hàng triệu đoạn DNA đồng nhất từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysacharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Ngày nay, PCR được dùng rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực về sinh học (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Nguyên tắc
Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gen quan
tâm bằng mồi đặc hiệu kết hợp với hoạt động của enzyme chịu nhiệt polymerase như Taq DNA polymerase trong một chu trình nhiệt hợp lý. Tác động của mồi được xem như yếu tố đánh dấu hoạt động của enzyme polymerase khi nó được gắn kết vào DNA mạch đơn dùng làm khuôn trong giai đoạn bắt cặp. Mồi bên trái tác động trên sợi DNA chiều 3’- 5’ còn được gọi là mồi xuôi, mồi bên phải tác động trên sợi DNA chiều 5’- 3’. Tóm lại, khi các mồi kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại lên theo phản ứng chuỗi với enzyme polymerase (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005).
Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau (Hồ Thị Thùy Dương, 2002).
Bước 1: Biến tính (Denature): Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94- 950C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách hoàn toàn thành 2 mạch đơn.
Bước 2: Bắt cặp (Annealing): Nhiệt độ được hạ thấp đến mức cho phép các mồi bắt cặp được với mạch khuôn dao động từ 55- 650C, trong 30 giây- 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm của các mồi sử dụng.
Bước 3: Kéo dài (Extension)
Dưới tác động của enzyme DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn ở nhiệt độ 720C trong thời gian từ 30 giây đến vài phút.
Hình 2.4. Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR
Nguồn: http://www.universe-review.ca
Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếch đại lên rất nhiều lần. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n (m: là số bản sao của chuỗi mã hóa; n: là số chu kỳ).
Chỉ thị SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions- Kỹ thuật nhân bản vùng chuỗi được mô tả (Park et al., 2010).
Chỉ thị SCAR là kỹ thuật nhân DNA bằng PCR tạo ra các đoạn DNA tại những locus nhất định sử dụng các mồi đặc thù. SCAR được tiến hành bằng cách tách dòng sản phẩm PCR với các mồi ngẫu nhiên sau đó đọc trình tự hai đầu đoạn tách dòng. Dựa vào trình tự hai đầu này để thiết kế cặp mồi với độ dài 15 đến 30bp để nhân băng đơn với kích thước tương tự như phân đoạn được nhân dòng. Sự đa hình được xác định bằng sự có mặt hay vắng mặt của băng được nhân bản hoặc sự xuất hiện đa hình về chiều dài đồng thời chuyển chỉ thị trội thành chỉ thị SCAR đồng trội.
Kỹ thuật SCAR được dùng để phân tích thư viện genome, xác định các locus gen đặc thù và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử.
Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs- Đa hình các đoạn DNA khuếch đại dùng mồi đơn ngắn ngẫu nhiên) (Nguyễn Đức Thành, 2014)
Cơ sở của kỹ thuật RAPD là nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR dùng các mồi đơn ngẫu nhiên, ngắn (thường dưới 10 nucleotide) để tạo ra sự đa hình các đoạn DNA. Trình tự mồi RAPD là ngẫu nhiên với tỷ lệ GC tối thiểu là 40% (thường 50-80%), không có trình tự bazơ đầu xuôi và ngược giống nhau.
Sản phẩm PCR- RAPD thường được phân tách trên gel agarose 1,5- 2,0%. Kỹ thuật RAPD đơn giản, dễ thực hiện và không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu, có thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung.
Hạn chế của kỹ thuật RAPD là sản phẩm PCR không ổn định, tạo ra các chỉ thị trội, không phân biệt được các cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử.
RAPD sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền, đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di truyền, trong xác định loài và xác định con lai.
Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism- Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc) (Nguyễn Đức Thành, 2014)
Kỹ thuật AFLP được sử dụng để phát hiện đa hình DNA. Phân tích AFLP
được kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi để nhân chọn lọc các đoạn DNA được cắt hạn chế. Các cặp mồi thường tạo được từ 50-100 băng trong một phân tích. Số lượng băng phụ thuộc vào số nucleotide chọn lọc trong tổ hợp mồi. Kỹ thuật AFLP cho phép lấy DNA từ bất kỳ nguồn gốc nào.
Phân tích AFLP hiệu quả với một số ưu điểm như: độ tin cậy và lặp lại cao;
không cần thông tin về trình tự DNA của sinh vật nghiên cứu; khả năng phân tích số lượng lớn locus đa hình với một tổ hợp một trên một gel và có thể cho thấy các locus đặc thù; các số liệu có thể lưu giữ trong cơ sở dữ liệu để so sánh. Tuy nhiên, AFLP phải trải qua nhiều bước; DNA cần phải sạch, không có các chất ức chế hoạt động của enzyme cắt hạn chế; đòi hỏi công sức và giá thành cao. Kỹ thuật tạo ra chỉ thị trội, không phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử.
AFLP được sử dụng trong nghiên cứu lập bản đồ gen, đa dạng di truyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng giữa các kiểu gen có quan hệ gần, nghiên cứu cấu trúc di truyền nguồn gen và đánh giá phân hóa di truyền trong quần thể.
2.3.1.3. Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại
Chuỗi lặp lại có trật tự (Tandemly Repeated Sequence) là những trình tự lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thường được gọi là DNA vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lượng bản sao của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi.
Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats- Sự lặp lại các trình tự đơn giản) Chỉ thị này được phát triển bởi Litt và Luty năm 1989, là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2-6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn và vài chục lần. Các trình tự này tồn tại trong cơ thể sinh vật Eukaryote khá phổ biến, tùy từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn (Lê Thị Ánh Hồng, 2002).
Ưu điểm của chỉ thị SSR là dễ thực hiện, không tốn kém. SSR là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao, nhưng quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài. Tuy nhiên, SSR là một loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài động hay thực vật. Người ta sử dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gen, xây dựng bản đồ liên kết gen, trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây
trồng, bệnh hại và sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ allen thuộc một locus.
Chỉ thị dựa trên các trình tự microsatellite cụ thể ở từng locus từ nhiều loài như xà lách (Lactuca sativa L.), đại mạch (Hordeum vulgare L.), và lúa gạo (Oryza Sativa L.)... đã được công bố (Park et al., 2010).
Tiểu vệ tinh (Minisatellite)
Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6 nucleotide trở lên (thường vào khoảng 15 bp), bao phủ một vùng từ 0,5-3 kb. Không giống như DNA vệ tinh, tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và thường thay đổi rất nhiều về kích thước (Armour and Jeffreys, 1992). Có 2 loại DNA tiểu vệ tinh. Đó là DNA đầu mút nhiễm sắc thể và DNA tiểu vệ tinh siêu biến. DNA đầu mút nhiễm sắc thể nằm ở vai nhiễm sắc thể, gồm một vài kilobase. DNA tiểu vệ tinh siêu biến nằm ở vùng phụ đầu mút nhiễm sắc thể (Napvi et al., 1995).
2.3.2. Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng
Trong nông nghiệp, mục tiêu chính của các nhà chọn tạo giống cây trồng truyền thống là cải thiện các giống cây trồng hiện có, đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào một giống khác bằng phương pháp lai trở lại liên tục, chọn lọc các cá thể ưu tú trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo. Phương pháp này rất tốn kém, mất nhiều thời gian và chịu tác động của yếu tố môi trường. Sự ra đời của công nghệ chỉ thị DNA, chiến lược chọn giống nhờ chỉ thị phân tử đã giúp các nhà chọn giống thực vật và nhà di truyền học vượt qua nhiều vấn đề phải đối mặt trong chọn tạo giống truyền thống, chọn lọc một cách chính xác và hiệu quả hơn (Winter amd Kahl, 1995).
Chỉ thị phân tử hiện nay đã được sử dụng rộng rãi để theo dõi các locus và các vùng genome trong một vài chương trình chọn tạo giống cây trồng, như chỉ thị phân tử liên kết chặt với một số lượng lớn các tính trạng nông học và tính kháng bệnh có sẵn ở các loài cây trồng chính. Trong đó, chỉ thị DNA được tạo ra với số lượng lớn và rất hữu ích trong việc cải thiện giống cây trồng. Chẳng hạn, những chỉ thị này đã được sử dụng rộng rãi để xây dựng bản đồ phân tử. Sự liên kết của chúng với các gen/QTL kiểm soát các tính trạng kinh tế quan trọng cũng có thể được sử dụng trong một vài trường hợp gián tiếp chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) (Winter and Kahl, 1995).
Chỉ thị DNA cho phép nghiên cứu những biến đổi trong vật liệu di truyền của cơ thể sống ở cấp độ DNA. Ngoài việc ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền, trên cơ sở phân loại định danh và xác định kiểu gen của cá thể; chỉ thị DNA còn giúp nhà chọn giống xác định nhanh, sớm và chính xác bản chất di truyền của đối tượng cần chọn giống (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).
Cùng với sự tiến bộ của Công nghệ sinh học hiện đại đã phát hiện ra các chỉ thị về DNA đã trở thành công cụ đắc lực giúp các nhà di truyền chọn giống nghiên cứu một cách có hiệu quả về biến đổi di truyền trong quần thể tự nhiên, xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và quan hệ tiến hóa giữa loài và những nghiên cứu chi tiết hơn phát hiện những thay đổi trong genome (Trần Thị Hòa và Luduwig Triest, 2000). Một vài ứng dụng khác của chỉ thị phân tử bao gồm sự du nhập gen thông qua quá trình lai lại, sự di truyền đặc tính, chẩn đoán di truyền, nghiên cứu tổ chức genome và phân tích sự phát sinh loài. Ứng dụng trong chọn tạo giống thực vật, chỉ thị SSR đã được chứng minh và đề xuất như là sự lựa chọn của các chỉ thị trong số các chỉ thị phân tử hiện nay (Winter and Kahl, 1995).