Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các giống cà chua kháng, chống chịu và nhiễm bệnh sương mai tiến hành thí nghiệm như danh sách trong bảng 3.1:
Bảng 3.1. Danh sách các giống cà chua nghiên cứu
Nguồn: DNA này sẽ được dùng để khảo sát các chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai b. Chỉ thị phân tử
Sử dụng 5 chỉ thị phân tử đã được xác định từ các nghiên cứu trước đó bao gồm TOM236 (Zhu et al., 2006), SCU602F3R3 (Trương Thị Hồng Hải và cs, 2015) và 3 chỉ thị còn lại là SSR383, SSR69, LB3 (Kết quả đề tài, 2009-2012). Các chỉ thị lựa chọn tập trung trên vai dài nhiễm sắc thể số 9, gần vị trí chỉ thị TG591 (chỉ thị RFLP).
Hình 3.1. Vùng khảo sát chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 trên nhiễm sắc thể số 9
c. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA được thực hiện sử dụng mẫu lá non giai đoạn 2 đến 3 lá thật phục vụ xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3, theo phương pháp của Dorokhov and Klocke (1998), có cải tiến.
Định tính DNA bằng phương pháp điện di
Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA, tiến hành điện di trên gel agarose 1%. Dưới tác dụng của điện trường, do tích điện âm nên DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương. Đoạn DNA nào lớn thì di chuyển chậm, ngược lại đoạn DNA ngắn sẽ di chuyển nhanh và tách nhau ra. Do đó có thể phân tách được các đoạn DNA trong hỗn trên gel agarose.
d. Thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai và các mẫu giống khác nhau
Phản ứng PCR qua 5 chỉ thị nghiên cứu xác định trên các mẫu giống được liệt kờ trong bảng 3.1. Thành phần mỗi phản ứng 10àl như bảng 3.2 dưới đõy:
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với mồi Hóa chất
Nước (Di H2O) Đệm (Buffer 10X) dNTPs (10mM)
Mồi xuụi (F- Primer 50àM) Mồi ngược (R- Primer 50àM) Taq Polymerase (5U/àl) DNA mẫu (20ng/àl) Tổng thể tích
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Bước 1
2
3 Bảo quản
(*): Nhiệt độ gắn mồi- có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi cụ thể - Kiểm tra kết quả điện di sản phẩm PCR của từng chỉ thị. Điện di trên gel
agarose1,5%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, dưới hiệu điện thế 160V trong 70 phút. Sau đó, các băng DNA được quan sát khi đưa vào máy Geldoc.
3.5.1.2. Phương pháp xác định mức độ liên kết của chỉ thị phân tử thông qua đánh giá sự tương đồng giữa kiểu gen và kiểu hình tính kháng bệnh
Trong thí nghiệm này lựa chọn trong 5 chỉ thị phân tử đã công bố liên kết
với gen Ph3, tất cả đều đã được dùng để kiểm tra và cho đa hình trên các dòng/giống và bố mẹ kháng nhiễm. Tiến hành điều tra kiểu gen Ph3 bằng chỉ thị phân tử DNA trên quần thể F2 được tạo ra từ hạt của tổ hợp lai F1 giữa dòng 08TP73-10-4 chứa gen kháng Ph3 được tạo ra từ mẫu giống L3708 với dòng 08TP03-15-3-1 nhiễm bệnh, không chứa gen kháng (hình 3.2). Đồng thời đánh giá kiểu hình kháng nhiễm bằng lây nhiễm nhân tạo. Khoảng cách di truyền được tính theo phương pháp của Nei (1978) bằng tỷ lệ % cá thể trao đổi chéo của từng chỉ thị (Nei, 1978). So sánh tỷ lệ % cây trao đổi chéo giữa 5 chỉ thị nghiên cứu, chỉ thị phân tử nào có tỷ lệ % trao đổi chéo thấp nhất sẽ là chỉ thị có liên kết chặt nhất với gen Ph3 kháng bệnh sương mai.
Hình 3.2. Sơ đồ tạo quần thể F2 của tổ hợp lai 08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4 Nguồn: Viện Nghiên cứu Rau quả Hạt giống được xử lý bằng dung dịch NaOCl 1% trong 15 phút, rửa sạch dưới vòi nước trong 30 phút rồi hong khô trước khi gieo. Trong nhà lưới, gieo hạt vào khay nhựa (72 lỗ) chứa giá thể nền hữu cơ GT05 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa cung cấp phối trộn với xơ dừa sạch theo tỉ lệ 1:1 (theo thể tích). Chọn ngẫu nhiên 96 cây của quần thể F2 để tiến hành tách chiết DNA và đeo thẻ để đánh giá kiểu kình kháng nhiễm bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo.
Lây nhiễm bệnh nhân tạo
Theo Leontine Colon et al. (2004), lây nhiễm bệnh nhân tạo được thực hiện theo phương pháp lá tách rời (Lê Hồng Vinh và cs., 2008) cụ thể: Sau gieo 30-35 ngày, khi cây có 5-6 lá thật, ngắt lá thật thứ 4 (đã phát triển đầy đủ), sạch bệnh và ghi thẻ đánh dấu tương ứng với cây nghiên cứu, giữ trong khăn ẩm, mát. Đặt úp lá cà chua lên môi trường thạch nước (Water agar, Autoclaved 1210C, 17
min) trong đĩa Petri sau đú dựng Micropipet nhỏ vào giữa mỗi lỏ chột 30àl dung dịch bào tử (5000 bào tử/ml) nấm sương mai. Sau khi lây nhiễm, hộp petry được đậy kín lại, giữ trong tủ định ôn 170C. Việc đánh giá kiểu hình kháng nhiễm bệnh của 96 cá thể quần thể F2 được thực hiện sau lây nhiễm 7 ngày bằng phương pháp xác định số bào tử hình thành cụ thể:
Đếm số lượng bào tử hình thành (Lê Hồng Vinh và cs., 2008): Kháng bệnh (R): 0- ≤ 1x104 bào tử/ml; Chống chịu (H): 1,5- < 9,5 x 104 bào tử/ml;
Nhiễm bệnh (S): >104 bào tử/ml.
Hình 3.3. Lây nhiễm bệnh nhân tạo trên lá tách rời Nguồn nấm bệnh:
Sử dụng chủng phân lập RIFAV, thu thập tại khu ruộng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Rau Quả, Gia Lâm- Hà Nội, vụ Đông Xuân 2017. Lá bệnh điển hình được thu thập và phân lập theo phương pháp của Caten và Jinks (1968) có cải tiến trên môi trường V8.
A B C
Hình 3. 4. Quá trình phân lập nấm sương mai (A-mẫu bệnh, B- Phân lập trên môi trường V8, C- Hình dạng bọc bào tử
động dưới kính hiển vi)
Sau phân lập, nguồn bệnh được kiểm tra lại qua xác định hình thái bọc bào tử động dưới kính hiển vi. Để duy trì tính độc cao các isolate nấm liên tục được lưu trên mẫu lá cà chua tươi ở nhiệt độ 170C – 180C.