Sử dụng chỉ thị phân tử LB3 để xác định kiểu gen Ph3 quy định tính kháng bệnh sương mai trong các tổ hợp lai cà chua nghiên cứu. Thực hiện phản ứng PCR với 5 mẫu DNA của 5 giống/ tổ hợp lai, điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Kết quả điện di được thể hiện ở hình 4.8.
M 1 2 3 4 5
500bp
Hình 4.8. Ảnh điện di chỉ thị LB3 của tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm (M-thang chuẩn 100bp, 1-V1, 2-V2,
3-V3, 4-V4, 5-V5)
Kết quả điện di hình 4.8 cho thấy: So với giống đối chứng V1 (Savior) không mang gen Ph3, trong số 5 tổ hợp lai được khảo sát chỉ có duy nhất 1 giếng điện di số 2 của tổ hợp lai V2 (08TP85-2-3-10-1-1-1-6-3 × (08TP76 × 08TP65)5-3-7-3-3-1-1) chỉ xuất hiện một băng vạch duy nhất có kích thước 249 bp tương đương với băng vạch DNA mang gen kháng Ph3. Đây là tổ hợp lai mang gen Ph3 đồng hợp tử. Điều này cũng phù hợp với thực tế bởi cặp bố mẹ của tổ hợp lai V2 là 08TP85-2-3-10-1-1-1-6-3 (Ph3/Ph3) và (08TP76 × 08TP65)5-3-7-3-3-1-1 (Ph3/Ph3) đều mang gen Ph3 ở trạng thái đồng hợp tử.
Bên cạnh đó, kết quả điện di của các tổ hợp lai còn lại bao gồm V3 (08TP85- 2-3-10-1-1-1-7-2 × AVTO-9803-5), V4 (08TP85-2-3-5-1-1-1-10 × 11AV-10-3), V5 (08TP85-2-3-5-1-6-2-4 × 08TP86B-4-5-8-6-5-1) đều xuất hiện hai băng vạch với kích thước lần lượt 249 bp và 482 bp, chứng tỏ 3 tổ hợp lai này đều mang gen Ph3 ở trạng thái dị hợp tử. Điều đó khẳng định tính chính xác của chỉ thị LB3 trong chọn tạo giống cà chua kháng bệnh sương mai.
Kết quả xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua được thể hiện qua bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm
Ký hiệu Tên giống/tổ hợp lai
V1(đc) Savior
V2 08TP85-2-3-10-1-1-1-6-3
V3 08TP85-2-3-10-1-1-1-7-2
V4 08TP85-2-3-5-1-1-1-10 ×11FAV-10-3
V5 08TP85-2-3-5-1-6-2-4 × 08TP86B-4-5-8-6-5-1
Nguồn gen kháng bệnh của cà chua hầu hết được tìm thấy ở các loài hoang dại. Trong khi đó nước ta không phải là nơi nguyên sản của cà chua mà nó mới được du nhập và trồng trọt khoảng 100 năm nay. Tuy nhiên, kết quả lây bệnh nhân tạo cho thấy: Hầu hết các tổ hợp lai đều kháng bệnh hoặc chống chịu bệnh cao với mẫu phân lập. Điều này được giải thích là do các tổ hợp lai này mang gen kháng Ph3 kháng được mẫu phân lập nấm Phytophthora infestans.
Theo quy luật, sau khi xâm nhập vào ký chủ sợi nấm sẽ phát triển và vết bệnh lan rộng. Mô bệnh đổi màu xuất hiện triệu chứng đặc trưng và sợi nấm sinh ra rất nhiều bào tử trên bề mặt vết bệnh. Các giống kháng sẽ xuất hiện các tế bào chết bao quanh vết bệnh, số bào tử sinh ra ít hơn các giống mẫn cảm bệnh. Do đó, chúng tôi tiến hành đánh giá tính kháng bệnh sương mai của các giống/tổ hợp lai khảo nghiệm bằng phương pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.5.
Bảng 4.5. Đánh giá tính kháng bệnh sương mai của các tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm
Giống/tổ hợp lai
V1 V2 V3 V4 V5
Dựa vào bảng 4.5 cho thấy, 4 tổ hợp lai cà chua từ V2 đến V5 có số bào tử tạo thành thấp (<= 10 nghìn bào tử/ ml). Số lượng bào tử sinh ra của các dòng mang gen Ph3 ở trạng thái đồng hợp và dị hợp tử là tương đối khác nhau. Trong đó, tổ hợp lai V2 (dạng đồng hợp tử Ph3/Ph3) tạo ra ít bào tử nhất (1,5 x 104 bào tử/ml), lần lượt sau đó là V5, V4, V3 (đều ở dạng dị hợp tử Ph3/ph3). Tiếp theo, giống đối chứng V1 (Savior) không mang gen Ph3 tạo ra một số lượng lớn bào tử lớn (18,5 x 104 bào tử ). Điều này chứng tỏ vai trò tích cực của gen Ph3 đối với sự tăng tính kháng bệnh của các giống/tổ hợp lai cà chua chọn tạo.
Giống Savior
(nhiễm bệnh- ph3/ph3)
Tổ hợp V2
(kháng bệnh- Ph3/Ph3)
Tổ hợp V3
(chống chịu bênh – Ph3/ph3) Hình 4.9. Đánh giá tính kháng bệnh sương mai
của các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3
Hình ảnh các tổ hợp lai cà chua được lây nhiễm bằng phương pháp lá tách rời (hình 4.9) dưới đây cho thấy:
Sau lây bệnh nhân tạo 7 ngày, nấm sương mai phủ hầu hết lá ở giống đối chứng V1 (Savior), trái lại nấm bệnh không
dòng mang gen Ph3 ở trạng thái đồng hợp tử và dị hợp tử.
Các giống/tổ hợp lai thực hiện thí nghiệm sau khi được xác định kiểu gen Ph quy định tính kháng bệnh sương mai và lây nhiễm nhân tạo đánh giá tính kháng bệnh sẽ được trồng ra ruộng và tiếp tục chọn lọc theo các đặc tính nông sinh học (các đặc điểm về năng suất, đặc điểm hình thái và phẩm chất quả...) để phát triển ở các thế hệ tiếp theo.
4 7