3.1 PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ HAI LOÀI PILEA AFF. MARTINII VÀ
3.1.1 Xử lý mẫu thực vật và phân lập các chất từ loài Pilea aff. martinii
Bột lá P.aff. martinii (40 kg) đƣợc ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng (có bổ sung 1%NH4OH) trong 24 giờ (60 L x 4 lần). Các dịch chiết đƣợc gộp lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 5 kg cặn MeOH. Hòa tan cặn MeOH vào 10 L nước, acid hóa bằng dung dịch HCl 2N đến pH ~2 và chiết phân bố với EtOAc (20Lx5 lần) thu được phần dịch EtOAc và phần dịch nước có alkaloid. Bổ sung dung dịch NH4OH vào phần dịch nước đến pH~8-9 sau đó tiếp tục chiết phân bố với EtOAc (20Lx5 lần) thu đƣợc phần dịch chiết EtOAc có alkaloid.
Tiến hành cô cạn dịch chiết EtOAc dưới áp suất giảm thu được 35,1 gam cặn tổng alkaloid, kí hiệu là cặn PM. Việc thu nhận cặn chiết alkaloid tổng từ lá cây Pilea aff.
martinii đƣợc trình bày trong sơ đồ Hình 3.1.
Cặn PM đƣợc hòa tan bằng dichloromethane, tẩm với silica gel, trộn đều, cất loại dung môi, nghiền mịn, đƣa lên cột sắc kí silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexane/EtOAc (0-100% EtOAc, có bổ sung 2% NH4OH). Thu đƣợc 15 phân đoạn kí hiệu từ F1-F15. Quá trình sắc kí đƣợc theo dõi bằng TLC, hiện màu với thuốc thử Dragendoff và Ce(SO4)2, kết quả thấy các phân đoạn F1, F3, F5-F9, F14, F15 không có alkaloid. Tinh chế phân đoạn F2 (354mg) bằng sắc kí silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexane/EtOAc thu đƣợc 5 phân đoạn nhỏ, kí
40
hiệu F2.1-F2.5. Phân đoạn nhỏ F2.2 đƣợc tiếp tục tinh chế bằng PTLC, hệ dung môi triển khai n-hexane/ EtOAc (8/2,v/v) thu đƣợc hai chất rắn màu trắng, kí hiệu PM1 (6 mg) và PM2 (4 mg).
Hình 3.1 Sơ đồ thu nhận cặn chiết alkaloid tổng từ lá cây Pilea aff. martinii.
Phân đoạn F4 (320 mg), sau khi đƣợc tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi rửa giải n- hexane/EtOAc (gradient) thu đƣợc 6 phân đoạn nhỏ, kí hiệu F4.1-F4.6.
Phân đoạn nhỏ F4.2 (7 mg) tiếp tục đƣợc tinh chế bằng PTLC, hệ dung môi triển khai n- hexane/EtOAc (8/2, v/v) thu đƣợc 5 mg chất rắn màu vàng, kí hiệu PM3. Phân đoạn nhỏ F4.3 (8 mg) sau khi chạy PTLC với hệ dung môi triển khai n-hexane/EtOAc (7/3, v/v) thu đƣợc 2,5 mg chất rắn màu vàng, kí hiệu PM4. Từ phân đoạn nhỏ F4.4 (8 mg) đƣợc tinh chế bằng PTLC, hệ dung môi triển khai n-hexane/EtOAc (7/3, v/v) thu đƣợc 4 mg chất rắn màu vàng, kí hiệu PM7. Phân đoạn F10 (3 gam) đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (gradient) thu đƣợc 10 phân đoạn nhỏ kí hiệu F10.1-F10.8. Phân đoạn nhỏ F10.1 (70 mg) sau khi đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là n-hexane/acetone (gradient) thu đƣợc 30 mg F10.1.2. Tinh chế F10.1.2 trên PTLC với hệ dung môi triển khai là n-hexane/acetone (7/3, v/v) thu đƣợc 20 mg một chất rắn màu vàng kí hiệu PM5.
Phân đoạn nhỏ F10.7 (700 mg) đƣợc tiến hành sắc kí cột silica gel với hệ dung môi Bột lá cây
Pilea aff. martinii (40kg)
Cặn MeOH (5kg)
Dịch EtOAc
Dịch nước
Cặn PM (35,1g)
1. MeOH,NH4OH 1%, 60L x4lần 2.Cất loại dung môi
1. Thêm nước (10L), thêm HCl 2N đến pH ~2 2. Chiết bằng EtOAc, 20Lx5 lần
1. Thêm NH4OH đến pH ~8- 9 2. Chiết bằng EtOAc, 20Lx5 lần 3. Cất loại dung môi
41
n-hexane/acetone (gradient) thu đƣợc phân đoạn F10.7.3 có khối lƣợng 18 mg. Tiếp tục tinh chế F10.7.3 bằng PTLC với hệ dung môi n-hexane/acetone (7/3, v/v) thu đƣợc 5 mg chất rắn màu vàng, kí hiệu là PM6. Phân đoạn F11 (2 gam) đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (gradient) thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ kí hiệu F11.1-F11.3. Tinh chế phân đoạn nhỏ F11.1 (20 mg) bằng PTLC với hệ dung môi n-hexane/acetone (6/4, v/v) thu đƣợc 4 mg chất rắn màu vàng, kí hiệu PM9. Tinh chế phân đoạn F13 (10 gam) bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (gradient) thu đƣợc thu đƣợc 12 phân đoạn nhỏ kí hiệu F13.1-F13.12). Tinh chế phân đoạn nhỏ F13.1 (26 mg) bằng PTLC với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (6/4, v/v) thu đƣợc 6 mg chất rắn màu vàng, kí hiệu PM8. Quá trình phân tách cặn chiết PM đƣợc thể hiện ở sơ đồ Hình 3.2.
42
Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ loài Pilea aff. martinii.
F1
PM5 20 mg
PM6 5 mg F10.1.2
30 mg
PTLC H/A (7/3)
PTLC H/A (7/3) CC, H/A
(grad)
F10.7.3 18 mg
CC, H/A (grad)
F10.7 100 mg F10.1
70 mg
CC, H/E (grad)
PM8 6 mg PM9
4 mg mg
F13.1 26 mg
CC, H/E (grad) CC, H/E
(grad)
F11.1 20 mg
PTLC H/A (6/4) PTLC
H/A (6/4)
PM1 6 mg
PM2 4 mg
PM3 5 mg
PM4 5 mg
PM7 4 mg
PTLC H/E (8/2)
F14- F15 F2
354 mg
F3 F4
320 mg
F5-F9 F10
3 gam
F11 2 gam
F13 10 gam
F2.2 20,0mg
F4.2 7 mg
F4.3 8 mg
F4.4 12 mg
CC, H/E (grad) CC, H/E (grad)
PTLC H/E (8/2)
PTLC H/E (8/2)
PTLC H/E (7/3)
PM 35,1 gam
CC, H/E (grad) A: acetone; D: CH2Cl2
E: EtOAc; M: MeOH H: n-hexane; grad.: gradient
43