3.2.1 Xử lý mẫu thực vật và phân lập các chất
Một lƣợng nhỏ mẫu lá, quả, vỏ cây các loài A. poilanei đã đƣợc chiết ethyl acetate và thử sàng lọc hoạt tính với dòng tế bào ung thƣ biểu mô (KB). Kết quả cho thấy các cặn chiết thu đƣợc từ bộ phận vỏ cây thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao
49
hơn các bộ phận còn lại. Kết quả này giúp cho quá trình nghiên cứu tiếp theo tập trung vào cặn ethyl acetate vỏ cây A. poilanei.
Mẫu vỏ cây A. poilanei (1,18 kg) đƣợc ngâm chiết với ethyl acetate ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ (2,5 lít x 3 lần). Các dịch chiết đƣợc gộp lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 55,3g cặn chiết ethyl acetate (kí hiệu AP). Quá trình ngâm chiết mẫu thực vật đƣợc trình bày trong Hình 3.5.
Từ 55,3 gam cặn AP, tiến hành phân tách bắng sắc kí cột silicagel với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (gradient từ 0-100% EtOAc) thu đƣợc 13 phân đoạn kí hiệu F1-F13. Phân đoạn F6 (1,2 gam) đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/CH2Cl2 (gradient) thu đƣợc 15 mg chất AP2. Phân đoạn F8 (1,3 gam) đƣợc tinh chế bằng cột Sephadex với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (1/9, v/v) thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ kí hiệu F8.1-F8.3. Phân đoạn nhỏ F8.2 (640 mg) đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH (gradient) thu đƣợc các phân đoạn nhỏ F8.2.1 (25 mg) và F8.2.2 (40 mg). Kết tinh lại F8.2.1 trong EtOAc thu đƣợc 16 mg chất sạch, kí hiệu AP3. Phân đoạn nhỏ F8.2.2 đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel, hệ dung môi n-hexane/EtOAc (gradient) thu đƣợc 16,1 mg chất sạch, kí hiệu là AP1.
Phân đoạn F9 (2,02 gam), đem rửa nhiều lần bằng dung môi CH2Cl2 và kết tinh lại trong EtOH thu đƣợc 15 mg chất rắn ở dạng bột, màu trắng, kí hiệu là AP6. Phân đoạn F10 (5 gam) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n- hexane/EtOAc/MeOH (gradient) thu đƣợc 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu F10.1-F10.7.
Phân đoạn F10.5 (350 mg) tiếp tục đƣa lên cột sắc ký Sephadex với dung môi MeOH, sau đó phân đoạn F10.5.2 (60 mg) chứa vệt chất chính đƣợc tinh chế lại trên cột silicagel nhỏ, hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc (9/1, v/v) thu đƣợc 15 mg chất sạch ở dạng bột, màu vàng, kí hiệu là AP4. Phân đoạn nhỏ F10.2 đƣợc tinh chế bằng cột Sephadex với dung môi MeOH thu đƣợc 5 phân đoạn nhỏ, kí hiệu F10.2.1-F10.2.5.
Phân đoạn nhỏ F10.2.2 đƣợc rửa với hệ dung môi n-hexane/CH2Cl2 thu đƣợc 14,5 mg chất sạch ở dạng bột, màu vàng, kí hiệu là AP5. Phân đoạn F12 đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel, hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (gradient), thu đƣợc 15 mg chất
50
sạch ở dạng bột, màu vàng, kí hiệu là AP7. Quá trình phân lập các chất từ cặn AP đƣợc mô tả trong Hình 3.6.
Hình 3.5 Sơ đồ ngâm chiết vỏ cây Anacolosa poilanei.
Hình 3.6 Sơ đồ phân lập các chất từ loài A. poilanei.
AP6
15 mg
F8.2
640 mg
F9
2,02gam
F10
5 gam
F7
CC, D/M, grad
CC,Se, M/D ( 9/1)
Rửa CH2Cl2 KT, EtOAc
CC, Se, MeOH
CC, D/M (grad)
KT, EtOAc
CC
H/E/M (grad)
F8
1,3 gam
F8.2.1
25 mg
F8.2.2
40 mg
F10.2.2
28 mg
AP4
15 mg
AP5
14,5 mg
F10.2
150 mg
F10.5
350 mg
AP7
15 mg
F10.5.2
60 mg
AP2
15 mg
F1-F4 F6
1,2 gam
CC, H/E (grad)
F11 F12
4 gam
F13
AP3
16, mg
AP1
16,1 mg
CC, D/M (grad)
AP 55,3 gam
CC, H/D (grad) D: CH2Cl2, E: EtOAc
H: n-hexane, M: MeOH Grad: gradient, KT: kết tinh Se: Sephadex
CC, H/E (grad)
CC, Se, MeOH
CC, D/E, grad
Bột vỏ cây A. poilanei (1,18 kg)
Dịch chiết EtOAc Bã
Ngâmchiết với EtOAc 2,5 Lx3 lần
Cặn AP (55,37 gam)
Cât loại dung môi
51
3.2.2 Hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ vỏ cây Anacolosa poilanei
Hợp chất AP1: Acid 3α-p-coumaroyl-D:A-friedo-oleanane-27-oic (chất mới)
Chất bột màu trắng; đnc. 189-191oC; độ quay cực +21o (c 0,21;
CH3Cl); FT-IR νmax (cm-1): 3325, 1695, 1649, 1557, 1508, 1454, 1020;
ESI-HRMS: m/z 605,4165 [M+H]+ (tính toán theo lí thuyết cho công thức [C39H57O5]+, 605,4206);
1H NMR (CDCl3, 500MHz), 13C NMR (CDCl3, 125MHz): Xem Bảng 4.11 (trang 98).
Hợp chất AP2: Acid trichadenic A
Chất bột màu trắng; đnc. 302-304oC; độ quay cực + 30o (c 0,14;
CHCl3); FT-IR νmax (cm-1): 3670, 2949, 1715, 1557, 1506, 1454, 1020;
ESI-MS : m/z 457 [M-H]-;
1H NMR (CDCl3+CD3OD, 500 MHz): δ (ppm) 3,26 (1H, dt, J = 5,0 Hz;
11,0Hz, H-3); 0,83 (3H, d, J = 9,0 Hz, CH3-23 ); 0,72 (3H, s, CH3-24); 0,81 (3H, s, CH3-25); 0,90 (3H, s, CH3-26); 1,12 (3H, s, CH3-28); 1,10 (3H, s, CH3- 29); 0,94 (3H, s, CH3-30).
13C NMR (CDCl3+CD3OD, 125 MHz): δ (ppm) 19,5 (C-1); 35,6 (C-2);
72,0 (C-3); 52,8 (C-4); 37,1 (C-5); 41,1 (C-6); 18,0 (C-7); 52,8 (C-8); 37,7 (C- 9); 59,9 (C-10); 37,8 (C-11); 27,8 (C-12); 54,5 (C-13); 39,1 (C-14); 32,9 (C- 15); 35,8 (C-16); 30,5 (C-17); 43,1 (C-18); 36,3 (C-19); 28,3 (C-20); 32,5 (C- 21); 38,0 (C-22); 9,7 (C-23); 14,0 (C-24); 18,0 (C-25); 19,5 (C-26); 179,7 (C- 27); 31,0 (C-28); 30,6 (C-29); 35,1 (C-30).
Hợp chất AP3: Acid trichadonic
Chất bột màu trắng; đnc. 249-252oC; độ quay cực +5,3o (c 1,5; CHCl3);
FT-IR νmax (cm-1): 3746, 3671, 3645, 2949, 1715, 1649, 1555, 1506, 1456, 1394;
ESI-MS : m/z 455 [M-H]-;
52
1H NMR (CDCl3, 500 MHz), 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): Xem Bảng 4.12 (trang 102).
Hợp chất AP4: Acid 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo- oleanan-27-oic (chất mới)
Chất bột màu vàng nhạt; đnc. 245-247oC; độ quay cực +20,5o (c 0,3;
CH3OH); FT-IR νmax (cm-1): 3360, 2974, 2943, 1683, 1649, 1555, 1508, 1454, 1024;
ESI-HRMS: m/z 619,4042 [M-H]- (tính toán theo lí thuyết cho công thức [C39H55O6]-, 619,3999);
1H NMR (CDCl3, 500MHz), 13C NMR (CDCl3, 125MHz): Xem Bảng 4.13 (trang 104).
Hợp chất AP5: 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan- 27,15-α-lactone (chất mới)
Chất bột màu vàng; đnc. 291-293oC; độ quay cực +33o (c 0,12;
CH3OH); FT-IR νmax (cm-1): 3321, 2974, 2832, 1649, 1539, 1506, 1452, 1022;
ESI-HRMS: m/z 619,4004 [M+H]+ (tính toán theo lí thuyết cho công thức [C39H55O6]+, 619,3999);
1H NMR (CDCl3+ CD3OD, 500 MHz), 13C NMR (CDCl3+ CD3OD, 125 MHz): Xem Bảng 4.14 (trang 111).
Hợp chất AP6: β-sitosterol Chất bột màu trắng; đnc. 140-142oC;
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 3,48-3,52 (1H, m, H-3); 5,35 (1H, d, J
= 3,0 Hz, H-6); 0,68 (3H, s, CH3-18); 1,01 (3H, s, CH3-19); 0,92 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-21); 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-26); 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27); 0,85 (3H, t, J = 7,0 Hz, CH3-29).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ (ppm) 37,3 (C-1); 31,7 (C-2); 71,8 (C-3);
42,3 (C-4); 140,8 (C-5); 121,7 (C-6); 31,9 (C-7); 31,9 (C-8); 50,2 (C-9); 36,5 (C-10);
21,1 (C-11); 39,8 (C-12), 42,4 (C-13); 56,8 (C-14); 24,3 (C-15); 28,3 (C-16); 56,1 (C-17); 12,0 (C-18); 19,8 (C-19); 36,2 (C-20); 18,8 (C-21); 34,0 (C-22); 26,1 (C-23);
45,9 (C-24); 29,2 (C-25); 19,1 (C-26); 19,4 (C-27); 23,1 (C-28); 12,0 (C-29).
53
Hợp chất AP7: Amentoflavone Chất bột màu vàng; đnc. 260-261oC;
ESI-MS : m/z 539 [M+H]+; FT-IR νmax (cm-1): 3340, 2974, 2831, 1649, 1557, 1454, 1418, 1024;
1H NMR (CD3OD, 500 MHz), 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): Xem Bảng 4.15 (trang 116).