Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1. Tách chiết thu nhận dịch chiết tổng số từ mẫu thảo dược
Mẫu thảo dược dạng khô được nghiền thành bột mịn và chiết 2 lần trong dung môi ethyl acetate và methanol. Hỗn hợp gồm 5 g mẫu, cát biển sạch và ethyl acetate được nghiền thành dạng đồng nhất trong cối sứ rồi chuyển sang bình tam giác, bổ sung đủ 200ml. Sau đó, hỗn hợp được siêu âm trong 5-7 phút và khuấy từ 50 phút ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết được ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 20oC, lọc qua giấy lọc và thu dịch trong. Phần cặn còn lại được sử dụng để chiết lần 2 trong ethyl acetate, dịch trong sau khi ly tâm ở bước này được gộp với dịch trong lần 1 thu được 400 ml dịch chiết tổng số trong ethyl acetate. Phần cặn còn lại sau khi chiết trong ethyl acetate được để khô qua đêm trong tủ hút. Tương tự, 400 ml dịch chiết tổng số trong methanol được thu nhận từ phần cặn còn lại sau 2 lần chiết với methanol. Các dịch chiết được cô đặc về thể tích 5 ml bằng máy quay chân không ở nhiệt độ 40oC, sau đó để bay hơi tự nhiên thành dạng cao khô. Cao khô được bảo quản ở 40C và hòa tan lại bằng DMSO trước khi thử hoạt tính kháng khuẩn.
2.3.1.2. Mẫu sinh thiết
Mẫu sinh thiết niêm mạc hang vị dạ dày được lấy đúng tiêu chuẩn chọn mẫu, bảo quản trong dung dịch NaCl 0,9 % ở 40C và được cấy trong vòng 1 giờ sau khi nội soi. Các mẫu này được nghiền nát bằng cối nghiền và chuyển lên đĩa môi trường để nuôi cấy.
2.3.2. Phương pháp phân tích các thành phần dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng Sắc ký là phương pháp phân tích khi một pha di động khai triển trên một pha tĩnh mà từ đó hỗn hợp các chất khác nhau được phân tách thành từng phần. Sắc ký lớp mỏng được E. Stahl giới thiệu vào năm 1957. Tuy nhiên, hiện nay phương pháp này vẫn được sử dụng do có nhiều ưu điểm như thời gian khai triển ngắn, khả năng phân tách cao.
Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng dựa vào hiện tượng hấp thụ trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh (có thể là silicagel, cellulose, aluminum). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hay tấm plastic. Hệ dung môi khai triển được đựng trong bình có nắp kín, bản mỏng có lớp hấp phụ được nhúng vào lớp dung môi, dung môi di chuyển lên trên làm cho hỗn hợp mẫu chạy từ vị trí chấm lên phía trên bản mỏng.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích trên bản sắc ký lớp mỏng là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách dịch chuyển của chất và khoảng dịch chuyển của dung môi
và 0 <Rf<1
Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm
Để phát hiện các vết dịch chuyển có thể soi bản sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại, hoặc sử dụng các thuốc thử thích hợp. Trong nghiên cứu này, 3 l chất chuẩn nồng độ 1,5 mg/ml và 5 l mẫu cao chiết thảo dược nồng độ 50 mg/ml được chấm lên cùng một bản sắc ký 60 F254 (Merck) kích thước 10x 8,5 cm. Sau đó, bản sắc ký được đặt vào bình đựng các dung môi, và được soi dưới ánh sáng tử ngoại để so sánh vị trí băng và màu sắc băng của chất chuẩn tinh sạch so với băng ở mẫu nghiên cứu để định tính sự có mặt của một số chất chuẩn trong dịch chiết nghiên cứu. Một số hệ dung môi khai triển sắc ký lớp mỏng sử dụng là 50 % Toluene: 30 % Ethyl acetate: 10 % Acetone: 10 % acid Formic (TEAF-5:3:1:1); 52,6 % cloroform: 28 % acid acetic: 10,5 % methanol: 8,9 % H2O; 63,2 % butanol: 15,8 % acid acetic: 21 % H2O.
Rf =
2.3.2. Phân lập vi khuẩn H. pylori 2.3.2.1. Phương pháp nhuộm giemsa
Nhuộm giemsa là phương pháp nhuộm đặc hiệu để phát hiện và chẩn đoán H. pylori trong mô bệnh học. Phương pháp này dùng giemsa để làm nổi bật các tế bào khác nhau trong mô bệnh.
Đầu tiên, mẫu sinh thiết được cố định trên lam kính, dung dịch giemsa gốc được nhỏ vào vết cố định. Sau 1 phút, vết cố định được rửa bằng nước để tẩy màu thuốc nhuộm. Tiếp theo, lam kính được làm khô và đem đi quan sát dưới kính hiển vi. Mẫu sinh thiết nào có mặt H. pylori được nuôi cấy để phân lập vi khuẩn.
2.3.2.2. Nuôi cấy vi khuẩn H. pylori
Mẫu sinh thiết được nghiền nỏt trong 100 àl dung dịch NaCl 0,9 % bằng chày nghiền. Dịch sau khi nghiền được cấy ria 3 pha hoặc cấy trải trên đĩa thạch Columbia agar bổ sung 5 % hồng cầu máu cừu và kháng sinh chọn lọc để phân lập vi khuẩn H. pylori (Helicobacter pylori Selective Suppliment-Oxoid). Các đĩa thạch được ủ ở 370C trong điều kiện vi hiếu khí tạo bởi túi tạo môi trường GaspakTM (BD). Kết quả được đọc sau 7 ngày với sự xuất hiện của các khuẩn lạc khỏ trong suốt hoặc xám nhạt, đường kính 1-2 mm.
Khuẩn lạc nhỏ này được kiểm tra khả năng sinh các enzyme oxidase, catalase, urease và nhuộm Gram quan sát sự bắt màu thuốc nhuộm cũng như hình dạng tế bào. Sau đó, các khuẩn lạc là Gram (-) có khả năng sinh các enzyme trên được kiểm tra chính xác một lần nữa bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa lipase của vi khuẩn H. pylori.
2.3.2.3. Phương pháp nhuộm Gram Nguyên tắc:
Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có lớp peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh [26].
Phương pháp tiến hành:
Vết bôi được tạo bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính sạch. Sau đó, đốt
nóng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, rồi dùng để lấy khuẩn lạc trên đĩa thạch hoặc trong ống giống và đưa vào giọt nước. Vết bôi được cố định bằng cách hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn. Một giọt tím kết tinh được nhỏ lên bao phủ hoàn toàn vết bôi và nhuộm trong thời gian 1 phút. Sau đó, vết bôi được rửa bằng nước cất và thấm khô.
Tiếp theo, vết bôi được nhuộm với lugol tương tự như nhuộm với tím kết tinh, rửa bằng cồn trong 30 giây và thấm khô rồi nhuộm safain trong 2 phút. Cuối cùng lam kính được rửa bằng nước cất, thấm khô và đem soi trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại x100. Nếu vi khuẩn bắt màu hồng thì chủng vi khuẩn đó là Gram (-) còn nếu có màu tím thì vi khuẩn đó là Gram (+).
2.3.2.4. PCR xác định vi khuẩn H. pylori
PCR là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn ADN mà không cần sử dụng các bộ máy sao chép của sinh vật sống như E. coli, nấm men. Dựa theo nghiên cứu của Ruiz và cs năm 2005, cũng như tính bảo thủ của gen mã hóa enzyme lipase, nghiên cứu thực hiện phản ứng PCR để xác định vi khuẩn H. pylori sử dụng cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho gen lipase với khuôn là dịch chứa vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm. Trình tự mồi đặc hiệu cho gen mã hóa lipase nhân lên đoạn gen có kích thước 921 bp (oligo lipase 0901) được thiết kế bởi phòng Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học- Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzyme và Protein. Các thành phần phản ứng PCR như sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch (àl)
H2O cất khử trùng, khử ion 13,9
Đệm DreamTaq 10x 2,5
dNTPs 2 mM 2,5
Mồi xuôi 10 pmol 1
Mồi ngược 10 pmol 1
DreamTaq 5 u/àl 0,1
Khuôn 4
Tổng phản ứng 25
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR gồm 4 bước. Bước 1 biến tính khởi động ở 94oC trong 5 phút. Bước 2 lặp lại 30 chu kỳ gồm 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở
54oC trong 30 giây và kéo dài mạch ADN ở 72oC trong 50 giây. Bước 3 tổng hợp cuối cùng ở 72oC trong 7 phút và cuối cùng giữ phản ứng ở 4oC. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 %.
2.3.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng một số loại kháng sinh phổ biến của H. pylori bằng Epsilometer test (Etest)
Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng một số loại kháng sinh phổ biến được thực hiện với 7 chủng H. pylori (Ký hiệu BG1, BG2,.., BG7) sử dụng thanh Etest.
Các mẫu vi khuẩn phân lập được khẳng định là H. pylori được chuẩn bị ở độ đục McFarland 2 (OD625nm = 0,451, khoảng 6x108 tế bào), cấy vào các đĩa thạch máu, để khô và đặt các thanh kháng sinh LEV, AMX, MTZ vào. Sau đó đĩa được ủ ở 37oC trong điều kiện vi hiếu khí. Kết quả được đọc sau 5 ngày. Kết quả MIC của kháng sinh tương ứng với đỉnh của vòng elip vô khuẩn giao với thanh Etest.
2.3.4. Xác định hoạt độ ức chế vi khuẩn H. pylori của dịch chiết thảo dược
Các mẫu vi khuẩn H. pylori sau khi được kiểm tra chính xác bằng phản ứng PCR được nuôi cấy để lên đủ lượng tế bào cần thiết cho thử hoạt tính. Chủng BG7 được sử dụng cho thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế của dịch chiết. 100 l dịch vi khuẩn H. pylori được chuẩn bị ở độ đục McFarland 2 được cấy lên đĩa thạch máu Columbia. Cao chiết thảo dược được hòa tan trong DMSO nồng độ 200 mg/ml, và 20 l dịch chiết được cho lên khoanh giấy (đường kính 6 mm), đợi khô và đặt vào đĩa có trải sẵn vi khuẩn. Sau đó đĩa được ủ ở 37oC trong điều kiện vi hiếu khí. Kết quả vòng kháng khuẩn có thể quan sát sau 5 ngày. Hoạt độ ức chế của dịch chiết trên vi khuẩn được đánh giá theo đường kính ức chế. Đường kính ức chế từ 0,8- 1,4 cm: mẫu được đánh giá hoạt tính yếu ( ); nếu đường kính ức chế trong khoảng từ 1,4-2,5 cm: hoạt độ tương đương (++), nếu đường kính trên 2,5 cm: hoạt độ ức chế được đánh giá (+++).