3.1. Phân tách các chất
3.1.2. Định tính một số chất chuẩn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Trong quá trình tối ưu hệ dung môi pha động cho sắc ký lớp mỏng, các tỷ lệ n-hexan: ethyl acetate khác nhau đã được thử nghiệm kết hợp với một số dung môi phân cực mạnh như methanol, H2O, acid acetic, acid formic.
Theo Bladt (1996), hệ dung môi 53,6 % Cloroform: 28,6 % Acid acetic: 10,7
% Methanol: 7,1 % H2O (Hệ 1) được sử dụng để sắc ký Glycyrrhizic acid (G) [29].
Tuy nhiên, với hệ dung môi này, khi không sử dụng thuốc hiện màu, băng G chỉ quan sát được ở bước sóng 254 nm. Trên sắc ký đồ, băng G kéo vệt, hệ số Rf =0,65.
Tỷ lệ dung môi trong pha động được thay đổi để sắc ký băng G được rõ nét. Sau khi thử nghiệm, hệ dung môi 2 gồm: 52,6 % cloroform: 28 % acid acetic: 10,5 % methanol: 8,9 % H2O cho băng G rõ nét, hệ số Rf = 0,65 (Hình 3.1 a). Vì vậy, sự có mặt của hợp chất G trong các mẫu dịch chiết được xác định bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi 2.
Berberine (B) là một kháng sinh thực vật, có phổ kháng khuẩn rộng. B đã được Bae và cs (1998) xác định có khả năng ức chế vi khuẩn H. pylori [25,48]. Hệ dung môi 66,7 % Butanol: 16,65 % Acid acetic: 16,65 % H2O (Hệ 3) được sử dụng để sắc ký B [25]. Trên sắc ký đồ, băng B lên thấp, kéo vệt dài, không rõ nét như trong nghiên cứu. Tỷ lệ các dung môi thành phần được thay đổi để tăng độ phân cực của hệ chạy sắc ký. Cuối cùng, với 63,2 % butanol: 15,8 % acid acetic: 21 % H2O
(Hệ 4), trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 366 nm băng B lên đậm, rõ nét, có màu vàng chanh với hệ số Rf = 0,53 (Hình 3.1 b). Do đó, hệ dung môi này phù hợp để sắc ký xác định các thảo dược chứa B.
Hệ dung môi 50 % Toluene: 30 % Ethyl acetate: 10 % Acetone: 10 % Acid formic (TEAF-5:3:1:1-hệ dung môi phổ biến để sắc ký nhiều loại thảo dược) (hệ 5) được dùng để sắc ký Quercetin (Q). Dưới ánh sáng thường, có thể quan sát băng Q có màu vàng nhạt. Trên sắc ký đồ, cũng có thể quan sát thấy băng Q ở bước sóng tử ngoại ngắn 254 nm, băng Q rõ nét, không bị kéo vệt, hệ số Rf = 0,54. Hệ dung môi này được sử dụng để sắc ký xác định các thảo dược chứa Q (Hình 3.1 c).
Hình 3.1. Tối ưu hệ dung môi sắc ký với chất chuẩn
a. Sắc ký đồ Glycyrrhizic acid quan sát dưới bước sóng 254 nm
(1) Hệ dung môi: 53,6 % Cloroform: 28,6 % Acid acetic: 10,7 % Methanol:
7,1 % H2O
(2) Hệ dung môi: 52,6 % Cloroform: 28 % Acid acetic: 10,5 % Methanol:
8,9 % H2O
b. Sắc ký đồ Berberine ở bước sóng 366 nm
(1) Hệ dung môi: 66,7 % Butanol: 16,65 % Acid acetic: 16,65 % H2O (2) Hệ dung môi: 63,2 % Butanol: 15,8 % Acid acetic: 21 % H2O
c. Sắc ký đồ Quercetin quan sát dưới bước sóng 254 nm khi sử dụng hệ dung môi 50 % Toluene: 30 % Ethyl acetate: 10 % Acetone: 10% Acid formic
3.1.2.2. Định tính một số chất chuẩn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Bảng 3 thể hiện sự có mặt của 3 chất chuẩn (Quercetin-Q, Berberine-B và Glycyrrhizic acid-G) trong dịch chiết thảo dược được xác định bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Nếu trong dịch chiết xuất hiện băng ở vị trí ngang với chất chuẩn, dịch chiết được đánh giá có chứa chất chuẩn (ký hiệu )
Bảng 3.2. Sự có mặt của một số chất chuẩn trong dịch chiết thảo dược
Mẫu Dung môi EtAc Dung môi Met
B G Q B G Q
Bắc mộc hương - - - +
Bạch thược - - - -
Bạch truật - - + - - -
Bồ công anh - - - -
Cam thảo - + - - + -
Chè dây - - + + - -
Dạ cẩm - - - +
Đỗ rừng - - - -
Hành tây tím - - - -
Hành tím - - - +
Hoàng bá nam - - + - - +
Hoàng kỳ - - + - - -
Hoàng liên + - + + - -
Kim ngân hoa - - + + - -
Lá khôi - - - -
Liên kiều - + + - - -
Lô hội - - - -
Nam khổ sâm - - - - + -
Nghệ đen - - + + - +
Nghệ vàng + - - + - -
Quán chúng - - + - - +
Quế - - - + - -
Sa nhân - - - +
Sơn đậu căn - - - -
Thăng ma - - + - - +
Thổ phục linh - - + + + +
Tô mộc - - + + - +
Tràm - - - -
Trần bì - - - + - +
Trầu không - - - -
Quy ước:(+) chứa chất chuẩn, (-) không chứa chất chuẩn
Trong 60 dịch chiết nghiên cứu, có 55 dịch chiết không chứa Glycyrrhizic acid, chỉ có 5 dịch chiết chứa G là cam thảo/Met, thổ phục linh/Met, cam thảo/EtAc, liên kiều/EtAc, nam khổ sâm/Met (Hình 3.2a). Theo nghiên cứu của Bladt [33], hệ dung môi 1 (53,6 % Cloroform: 28,6 % Acid acetic: 10,7 % Methanol: 7,1 % H2O) cũng được sử dụng để sắc ký xác định G trong một số dịch chiết thảo dược, kết quả cho thấy băng Glycyrrhizic acid có hệ số Rf = 0,5, rõ nét, không kéo vệt, các băng chất của dịch chiết tách khá tốt. Hệ dung môi sử dụng để sắc ký trong nghiên cứu có độ phân cực cao hơn hệ 2 dẫn tới hệ số Rf cũng cao hơn (0,65 so với 0,5), tuy nhiên, các băng chất phân tách không tốt như tài liệu (Hình 3.2a).
Theo dược điển Việt Nam, Glycyrrhizic acid có nhiều ở cam thảo, đã có một số nghiên cứu tách chiết thành công Glycyrrhizic acid từ cam thảo, kết quả sàng lọc cũng thống nhất với các nghiên cứu của một số nhóm sử dụng cam thảo làm nguyên liệu
Hình 3.2. Sắc ký đồ xác định Glycyrrhizic acid và Berberine ở một số thảo dược (a) Sắc ký đồ xác định Glycyrrhizic acid ở một số thảo dược với hệ dung môi 52,6 % Cloroform: 28 % Acid acetic: 10,5 % Methanol: 8,9 % H2O ở bước sóng 254 nm
1: Liên kiều/EtAc, 2: Glycyrrhizic acid, 3: Cam thảo/Met, 4: Thổ phục linh/Met, 5: Cam thảo/EtAc, 6: Nam khổ sâm/Met
(b) Sắc ký đồ xác định Berberine ở một số thảo dược với hệ dung môi: 63,2 % Butanol: 15,8 % Acid acetic: 21 % H2O ở bước sóng 366 nm
7: Berberine, 8: Chè dây/Met, 9: Hoàng liên/EtAc, 10: Hoàng liên/Met
Trên sắc ký đồ, các băng chất của dịch chiết thảo dược không tách tốt, tuy nhiên vẫn có thể phát hiện được băng ở vị trí của chất chuẩn Berberine ở trong một số dịch chiết. Kết quả sắc ký bản mỏng cho thấy, 10/60 dịch chiết nghiên cứu chứa Berberine (khoảng 16.7 %). Trong các dịch chiết chứa Berberine, chỉ có duy nhất mẫu hoàng liên, băng B lên khá đậm nét khi được chiết bằng cả hai loại dung môi.
Dịch chiết chè dây/Met cũng chứa Berberine với băng rõ nét. Các dịch chiết chứa B còn lại (kim ngân hoa/Met, nghệ đen/Met, nghệ vàng/Met) băng rất mờ. Trên sắc ký đồ hình 3.2b có thể thấy các dịch chiết hoàng liên/EtAc, hoàng liên/Met, chè dây/Met có ít băng chất, các băng tách nhau hoàn toàn, hơn nữa băng khá đậm nét, do vậy có thể được sử dụng các dịch chiết này để làm nguồn thu nhận chất B.
Các dịch chiết thảo dược chứa Quercetin được xác định bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển là TEAF (5:3:1:1). Trên sắc ký đồ, có thể thấy với hệ dung môi này, nhiều dịch chiết thảo dược cho các băng chất tách biệt rõ ràng, chỉ một số ít dịch chiết không phân tách tốt. Ở bước sóng ngắn và ở ánh sáng thường, có thể nhận thấy băng Q có mặt ở nhiều dịch chiết. 28/60 dịch chiết nghiên cứu có chứa Q thuộc 20 loại thảo dược. Với dịch chiết hoàng bá nam/Met, tô mộc/EtAc, tô mộc/Met băng Q hiện lên đậm nét, ở các dịch chiết còn lại, băng Q rất mờ.
Hình 3.3. Sắc ký đồ Quercetin và một số dịch chiết chứa Quercetin trong hệ dung môi TEAF (5:3:1:1)
(a) Sắc ký đồ Quercetin
1: Ở bước sóng 254 nm, 2: Dưới ánh sáng thường Rf = 0,54
(b) Sắc ký đồ xác định Quercetin ở một số dịch chiết dưới ánh sáng thường
3: Quercetin, 4: Hoàng bá nam/Met, 5: Hành tím/Met, 6: Hoàng bá nam/EtAc, 7: Tô mộc/Met
Trên sắc ký đồ có thể nhận thấy các mẫu hoàng bá nam/Met, hoàng bá nam/EtAc, hành tím/Met có ít băng chất, các băng phân tách khá tốt, băng Quercetin tách hoàn toàn so với các băng còn lại, như vậy các dịch chiết này có thể được sử dụng các dịch chiết này để thu nhận Q (hình 3.3b). Q được biết là có mặt trong nhiều loại cây trồng và dược liệu. Gần đây có nhiều nghiên cứu thực hiện tách chiết Q từ hành tây, nho [31]. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với các công bố trước đó.
Theo kết quả tổng hợp trong bảng 3.2 ở trên, 24/60 dịch chiết nghiên cứu không chứa chất chuẩn, 36 dịch chiết còn lại chứa ít nhất 1 chất chuẩn. Những dịch chiết được xác định là không chứa chất chuẩn được ưu tiên sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo.