3.2.1. Tối ưu phương pháp phân lập, nuôi cấy và xác định vi khuẩn H. pylori Các mẫu sinh thiết của bệnh nhân viêm dạ dày tá tràng đã được xác định là có mặt vi khuẩn H. pylori bằng phương pháp nhuộm giemsa, test urease được sử dụng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn. Dưới kính hiển vi điện tử độ phóng đại x100, vi khuẩn H. pylori trong mẫu sinh thiết có dạng xoắn, cong hình chữ S và bắt màu tím của thuốc nhuộm (hình 3.4a). Sau 5-7 ngày nuôi cấy ở điều kiện vi hiếu khí, trên mặt đĩa thạch xuất hiện những khuẩn lạc màu trắng trong, nhỏ li ti, đường kính khoảng 1-2 mm (Hình 3.4b). Các khuẩn lạc nhỏ li ti trắng trong, có khả năng sinh các enzyme urease, oxidase, catalase được nhuộm Gram (Hình 3.4c), cho thấy vi khuẩn H. pylori là bắt màu thuốc nhuộm Gram (-) và sau khi nuôi cấy, vi khuẩn có dạng hơi cong hoặc thẳng. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu về đặc điểm của H.
pylori đã được công bố [7,42,58], do đó có thể xác định ban đầu các mẫu này là vi khuẩn H. pylori.
Phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen mã hóa cho lipase của vi khuẩn H. pylori chủng tham chiếu 26695 được sử dụng để xác định chính xác vi khuẩn đã được cấy chuyển là H. pylori.
Sau khi điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1 %, đoạn mồi đặc hiệu nhân lên đoạn gen có kích thước 921 bp (đối chứng dương). Kết quả điện di (Hình 3.4d) cho thấy mẫu 1 có băng rộng và sáng ngang với băng của đối chứng dương, mẫu 2 băng sáng tương tự đối chứng dương, có thể khẳng định các mẫu 1, 2 là vi khuẩn H. pylori. Một số mẫu có hình dạng khuẩn lạc giống vi khuẩn H. pylori, là vi khuẩn Gram (-), có khả năng sinh các enzyme oxidase, catalase, urease nhưng không có băng đặc hiệu giống đối chứng dương nên không được tiếp tục sử dụng sau đó. Các mẫu cho băng đặc hiệu được sử dụng cho các thử nghiệm đánh giá khả năng kháng kháng sinh và ức chế vi khuẩn của dịch chiết.
Hình 3.4. Một số hình ảnh phân lập và xác định vi khuẩn H. pylori
(a) Hình ảnh nhuộm giemsa mẫu sinh thiết dạ dày (độ phóng đại x100)
(b) Đĩa nuôi cấy mẫu sinh thiết sau 1 tuần trên môi trường Columbia agar, 5 % máu cừu.
a b
c d
(c) Ảnh nhuộm Gram mẫu vi khuẩn nghi ngờ là H. pylori sau khi nuôi cấy (d) Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa cho lipase của vi
khuẩn H. pylori
(-): Đối chứng âm; M: Marker 1kb Thermo; (+): Đối chứng dương; 1, 2: sản phẩm PCR các mẫu vi khuẩn theo thứ tự.
Nuôi cấy phân lập H. pylori gặp nhiều khó khăn vì vi khuẩn khó nuôi cấy, mọc chậm, cần môi trường chọn lọc, giàu dinh dưỡng và vi hiếu khí. Tỷ lệ nuôi cấy phân lập vi khuẩn thành công từ những bệnh nhân bị nhiễm H. pylori phụ thuộc vào nhiều yếu tố: lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển, môi trường và phương pháp nuôi cấy.
Trước khi thu mẫu nội soi với các tiêu chí chọn mẫu như phụ lục 1, nghiên cứu được thực hiện với các mẫu chỉ được test urease dương tính. Sau nhiều lần nuôi cấy với các mẫu nội soi này, một số mẫu không có vi khuẩn với hình dạng đặc trưng, một số mẫu xuất hiện khuẩn lạc điển hình của H. pylori đồng thời kết quả nhuộm Gram và test các enzyme oxidase, catalase dương tính, có thể xác định sơ bộ là vi khuẩn H. pylori. Tuy nhiên, khi kiểm tra những mẫu này bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu, kết quả thu được là âm tính, chứng tỏ các mẫu này không phải là H. pylori. Tỷ lệ phân lập nuôi cấy thành công là 0 %. Vì vậy, tiêu chí thu mẫu được thay đổi, các mẫu test urease dương tính và nhuộm giemsa soi dưới kính hiển vi phát hiện H. pylori được nuôi cấy phân lập vi khuẩn cho thử nghiệm. Đồng thời, các mẫu nội soi được nuôi cấy tại điểm lấy mẫu chỉ trong vòng 1 giờ sau khi thu thập để tỷ lệ nuôi cấy thành công cao hơn [9]. Với sự thay đổi này, từ 30 mẫu sinh thiết dạ dày của các bệnh nhân viêm dạ dày tá tràng được xác định dương tính với vi khuẩn H.
pylori, sau 1 tuần nuôi cấy, với các bước kiểm tra định danh, 18 mẫu H. pylori đã được phân lập, tỷ lệ nuôi cấy thành công là 60 %, khá cao so với mức trung bình tỷ lệ nuôi cấy thành công ở Việt Nam (36,8 %-68,7 %) [3], tuy nhiên thấp hơn so với Farshad (2011) (99,2 %) [39] hay Đặng Ngọc Quý Huệ và cs (2013) (86,7 %) [9].
3.2.2. Đánh giá khả năng kháng một số loại kháng sinh của vi khuẩn H. pylori bằng Etest
Khả năng kháng kháng sinh của các mẫu H. pylori đã phân lập được xác định bằng cách sử dụng thanh Etest có thấm sẵn dải nồng độ kháng sinh với 3 loại kháng sinh phổ biến là AMX, LEV, MTZ (Oxoid). Với 7 mẫu H. pylori (ký hiệu BG1, BG2,…, BG7), kết quả cho thấy ở nồng độ cao nhất của 2 loại kháng sinh là LEV (32 àg/ml) và MTZ (256 àg/ml), 5 mẫu vi khuẩn H. pylori thử nghiệm vẫn mọc bình thường, chứng tỏ 5 mẫu này kháng LEV và MTZ, 2 mẫu còn lại vi khuẩn không mọc ở nồng độ kháng sinh thấp nhất. Đối với kháng sinh AMX, ở nồng độ thấp nhất (0,016 àg/ml) vi khuẩn khụng mọc ở bất kỳ mẫu nào, do vậy, cú thể kết luận cả 7 mẫu mẫn cảm với AMX. Kết quả đánh giá khả năng kháng một số loại kháng sinh phổ biến của H. pylori được thể hiện như trong hình 3.5 và bảng 3.3.
Hình 3.5. Kháng sinh đồ sử dụng Etest (Metronidazole) của chủng BG7 Dựa vào bảng thống kê mức độ kháng kháng sinh của 7 chủng vi khuẩn có thể thấy, tỷ lệ H. pylori kháng AMX là 0/7 (0 %). Tỷ lệ này thấp hơn so với tỷ lệ chung của châu Á (2008) là 11,6 % và của thế giới 14,4-18 %. Tỷ lệ H. pylori kháng LEV là 71,43 % (5/7) cao hơn so với một số nghiên cứu của tác giả trong nước như Đặng Ngọc Quý Huệ và cs (2013) (30,6 %) [9], Đinh Cao Minh (2013) (25,5 %) [14]. Đồng thời, tỷ lệ kháng LEV cũng cao hơn so với một số nghiên cứu
trên thế giới như nghiên cứu của O'Connor A (2013) (11,7 %) [61], hay Reyhan Caliskan (2015) (29,5 %) [34]. Tỷ lệ H. pylori kháng MTZ khoảng 71,43%
(5/7), thấp hơn so với nghiên cứu của Hsueh-Hsia Wu (2000) là 77,8 % [75], và cao hơn so Sook-Yin Lui ( 2003) (31,7 %) [54].
Bảng 3.3. Đánh giá tính mẫn cảm của H. pylori với một số loại kháng sinh Mức độ khỏng (àg/ml)
STT mẫu AMX MTZ LEV
BG1 0 256 32
BG2 0 0 0
BG3 0 256 32
BG4 0 256 32
BG5 0 256 32
BG6 0 0 0
BG7 0 256 32
Tỷ lệ kháng (%) 0 5/7 5/7
Các nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng kháng thuốc của vi khuẩn H. pylori ngày càng tăng. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới, đặc biệt từ các hợp chất thiên nhiên để khắc phục tình trạng này, đồng thời hạn chế những tác dụng phụ của thuốc có bản chất là thuốc tổng hợp hóa học là nhu cầu cấp thiết.
Sàng lọc thảo dược có hoạt tính ức chế vi khuẩn là bước đầu trong nghiên cứu tìm ra hợp chất mới kháng H. pylori để phát triển thuốc chữa bệnh dạ dày.
3.2.3. Hoạt độ ức chế vi khuẩn H. pylori của một số dịch chiết thảo dược
Phương pháp khuếch tán đĩa thạch là phương pháp tương đối nhanh và nhạy được sử dụng để thăm dò sơ bộ khả năng ức chế vi khuẩn H. pylori của các dịch chiết nghiên cứu. Kết quả điều tra khả năng ức chế vi khuẩn H. pylori (chủng BG7) được chỉ ra ở hình 3.6 và bảng 3.4. Các mẫu có hoạt tính cao được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả của nghiên cứu cho thấy tất cả các mẫu thảo dược đều có khả năng ức chế vi khuẩn H. pylori dù mạnh hay yếu. Trong 60 dịch chiết của 30 mẫu thảo dược, chỉ có 9 dịch chiết có hoạt tính thấp (hoạt độ ), 25 dịch chiết có hoạt tính trung bình (hoạt độ ), còn lại 26 dịch chiết có hoạt tính mạnh (hoạt độ ). Trong số 26 dịch chiết có hoạt tính ức chế H. pylori mạnh, dịch chiết trong EtAc chiếm tỷ lệ
nhiều hơn (14 dịch chiết trong dung môi EtAc so với 12 dịch chiết trong Met), được thu nhận từ 16/30 loại thảo dược, trong đó 10 loại thảo dược có hoạt tính mạnh khi chiết bằng cả hai loại dung môi. Bảng 3.4 thống kê hoạt độ ức chế vi khuẩn của dịch chiết thảo dược và chất chuẩn như sau:
Hình 3.6. Khả năng ức chế 1 chủng vi khuẩn H. pylori (BG7) của một số mẫu thảo dược và hợp chất tinh sạch (Glycyrrhizic acid, Quercetin)
Đa số các thảo dược thể hiện hoạt tính như nhau khi chiết bằng cả hai lọai dung môi (20/30 thảo dược) như bắc mộc hương, bạch truật, cam thảo. 5/30 thảo dược khi chiết bằng Met thể hiện hoạt tính mạnh hơn khi chiết bằng EtAc như bạch thược, hoàng bá nam, sơn đậu căn, tràm. 5/30 thảo dược còn lại (đỗ rừng, hành tím, kim ngân hoa, quế chi, thổ phục linh) khi chiết bằng EtAc thể hiện hoạt tính mạnh hơn so với chiết bằng Met. Thử nghiệm in vitro cho thấy, trong số các dịch chiết có hoạt tính mạnh, một số dịch chiết có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn H. pyloi như dịch chiết nghệ vàng, nghệ đen, trầu không, chè dây ở cả 2 loại dung môi. Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy hoàng liên có khả năng ức chế H. pylori mạnh với nồng độ ức chế tối thiểu nhỏ hơn 7,8 mg/ml [55], hoặc 100 àg/ml [48]. Theo một số tỏc giả, nghệ cũng cú tỏc dụng ức chế H. pylori mạnh, với nồng độ ức chế tối thiểu là 6,25 àg/ml [56], hay 16,6-62,5 àg/ml [77]. Hiện nay, đó có nhiều nghiên cứu trong nước về tác dụng tiêu diệt H. pylori trên bệnh nhân viêm
dạ dày nhiễm H. pylori như trong nghiên cứu của Vũ Nam và cs, chè dây có tác dụng tiêu diệt H .pylori trên 40 % [15]. Chính tác giả này vào năm 2000 cũng chỉ ra rằng dịch chiết toàn phần lá trầu không có khả năng tiêu diệt H. pylori trên 50 % [16]. Kết quả sàng lọc ban đầu của nghiên cứu cũng phù hợp với các công bố trước đó về tác dụng ức chế H. pylori mạnh của một số thảo dược như hoàng liên, nghệ, chè dây, trầu không.
Bảng 3.4. Khả năng ức chế vi khuẩn H. pylori của một số mẫu thảo dược và chất chuẩn
STT Mẫu Hoạt độ ức
chế
STT Mẫu Hoạt độ ức
chế Dịch
chiết EtAc
Dịch chiết Met
Dịch chiết EtAc
Dịch chiết Met
1 Bắc mộc hương +++ +++ 17 Lô hội ++ ++
2 Bạch thược + ++ 18 Nam khổ sâm +++ +++
3 Bạch truật ++ ++ 19 Nghệ đen +++ +++
4 Bồ công anh ++ +++ 20 Nghệ vàng +++ +++
5 Cam thảo ++ ++ 21 Quán chúng + +
6 Chè dây +++ +++ 22 Quế chi +++ ++
7 Dạ cẩm ++ ++ 23 Sa nhân +++ +++
8 Đỗ rừng +++ ++ 24 Sơn đậu căn + ++
9 Hành tây tím + + 25 Thăng ma ++ ++
10 Hành tím ++ + 26 Thổ phục linh +++ ++
11 Hoàng bá nam + +++ 27 Tô mộc +++ +++
12 Hoàng kỳ +++ +++ 28 Tràm + ++
13 Hoàng liên +++ +++ 29 Trần bì ++ ++
14 Kim ngân hoa +++ ++ 30 Trầu không +++ +++
15 Lá khôi ++ ++ 31 Q(DMSO) +
16 Liên kiều ++ ++ 32 G (EtOH) ++
Quy ước: Đường kính ức chế (+): 0,8-1,4cm; (++): 1,4-2,5 cm; (+++): >2,5cm, đường kính khoanh giấy 0,6 cm
Chất gây tan máu làm mất màu đỏ của máu, trong môi trường nuôi cấy và thử nghiệm hoạt tính ức chế vi khuẩn có thành phần máu cừu, do đó có thể xác định được những dịch chiết chứa chất làm tan máu (vòng sáng không có màu đỏ của máu-hình 3.7). Một số dịch chiết thảo dược khi thử nghiệm có vòng tan máu lớn,
nếu sử dụng thảo dược này nhiều có thể gây thiếu máu. Vì thế, những dịch chiết chứa thành phần gây tan máu không được ưu tiên sử dụng cho các nghiên cứu sau.
Hình 3.7. Khả năng gây tan máu của một số dịch chiết thảo dược Bảng 3.5. Khả năng gây tan máu của một số dịch chiết thảo dược và chất chuẩn
STT Mẫu
Khả năng gây tan máu
STT
Mẫu Khả năng gây tan máu Dịch
chiết EtAc
Dịch chiết Met
Dịch chiết EtAc
Dịch chiết Met
1 Bắc mộc hương + + 17 Lô hội - -
2 Bạch thược - - 18 Nam khổ sâm + +
3 Bạch truật + + 19 Nghệ đen + +
4 Bồ công anh + - 20 Nghệ vàng - -
5 Cam thảo - + 21 Quán chúng - -
6 Chè dây + - 22 Quế chi - -
7 Dạ cẩm - + 23 Sa nhân + +
8 Đỗ rừng - - 24 Sơn đậu căn - -
9 Hành tây tím - - 25 Thăng ma - -
10 Hành tím - - 26 Thổ phục linh - -
11 Hoàng bá nam - - 27 Tô mộc - -
12 Hoàng kỳ + + 28 Tràm - +
13 Hoàng liên + - 29 Trần bì - -
14 Kim ngân hoa - - 30 Trầu không + -
15 Lá khôi + - 31 Q (DMSO) -
16 Liên kiều - - 32 G (EtOH) -
Quy ước: (+) tan máu, (-) không tan máu
Trong 60 dịch chiết nghiên cứu, có 20 dịch chiết chứa chất gây tan máu thuộc 14/30 loại thảo dược. Bảng 3.4 và 3.5 cho thấy trong 26 dịch chiết có hoạt tính mạnh, có 12 dịch chiết chứa chất làm tan máu như dịch chiết nam khổ sâm/EtAc, chè dây/EtAc, nghệ đen/EtAc, nghệ đen/Met, sa nhân/EtAc. Những dịch chiết có hoạt tính ức chế H. pylori mạnh, có vòng tan máu nhỏ hoặc không có vòng tan máu được ưu tiên sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
Từ các thí nghiệm trên, bảng tổng hợp về hoạt độ ức chế vi khuẩn cũng như khả năng gây tan máu và sự có mặt của các chất chuẩn được thống kê như sau:
Bảng 3.6. Hoạt độ ức chế vi khuẩn, khả năng gây tan máu và sự có mặt một số chất chuẩn của các dịch chiết thảo dược
Mẫu
Dịch chiết EtAc Dịch chiết Met Hoạt độ
ức chế
Khả năng gây
tan máu
Chất chuẩn
Hoạt độ ức chế
Khả năng gây
tan máu
Chất chuẩn
Bắc mộc hương +++ + - +++ + +
Bạch thược + - - ++ - -
Bạch truật ++ + + ++ + -
Bồ công anh ++ + - +++ - -
Cam thảo ++ - + ++ + +
Chè dây +++ + + +++ - +
Dạ cẩm ++ - - ++ + +
Đỗ rừng +++ - - ++ - -
Hành tây tím + - + + - +
Hành tím ++ - + + - +
Hoàng bá nam + - + +++ - +
Hoàng kỳ +++ + + +++ + -
Hoàng liên +++ + + +++ - +
Kim ngân hoa +++ - + ++ - +
Lá khôi ++ + - ++ - -
Liên kiều ++ - + ++ - -
Lô hội ++ - - ++ - -
Nam khổ sâm +++ + - +++ + +
Nghệ đen +++ + + +++ + +
Nghệ vàng +++ - + +++ - +
Quán chúng + - + + - +
Quế +++ - - ++ - +
Sa nhân +++ + - +++ + +
Sơn đậu căn + - - ++ - +
Thăng ma ++ - + ++ - +
Thổ phục linh +++ - + ++ - +
Tô mộc +++ - + +++ - +
Tràm + - - ++ + -
Trần bì ++ - - ++ - +
Trầu không +++ + - +++ - -
Quy ước: Hoạt độ ức chế Đường kính ức chế (+): 0,8-1,4cm; (++): 1,4-2,5 cm;
(+++): >2,5cm, đường kính khoanh giấy 0,6 cm
Khả năng gây tan máu: (+): tan máu; (-): không tan máu Chất chuẩn (+): chứa chất chuẩn, (-): không chứa chất chuẩn.
Bảng 3.6 cho thấy chất chuẩn có trong mỗi dịch chiết có thể ảnh hưởng hoặc không ảnh hưởng đến hoạt độ ức chế vi khuẩn mà tùy thuộc vào từng loại thảo dược cũng như thành phần hợp chất trong đó. Trong 36/60 dịch chiết chứa chất chuẩn, 6 dịch chiết có hoạt độ ức chế yếu (hoạt độ ), 12 dịch chiết có hoạt độ trung bình ( ) và 17 dịch chiết hoạt độ ức chế mạnh. Chất chuẩn trong một số dịch chiết có hoạt tính mạnh có thể là những chất có hoạt tính ức chế vi khuẩn H. pylori. Tuy nhiên, trong những dịch chiết đó, một số dịch chiết chứa chất khác có hàm lượng rất lớn, có thể đây cũng là chất có hoạt tính ức chế vi khuẩn H. pylori mạnh.
Hình 3.8. Sắc ký đồ một số dịch chiết với hệ dung môi TEAF-5:3:1:1
(a) Dịch chiết hoàng bá nam/EtAc 1. Bước sóng 254 nm, 2. Bước sóng 366 nm, 3. Ánh sáng thường
(b) 4. Dịch chiết nghệ vàng/EtAc dưới ánh sáng thường
(c) 5. Dịch chiết trầu không/EtAc dưới ánh sáng thường 6. Dịch chiết trầu không/Met dưới ánh sáng thường
Trên sắc ký đồ ánh sáng thường (hệ dung môi khai triển TEAF-5:3:1:1) dịch chiết nghệ vàng/EtAc có băng màu vàng đậm, hệ số Rf = 0,67 (Hình 3.8b). Trong một số nghiên cứu, băng chất màu vàng đậm, hệ số di động Rf = 0,67 tách từ nghệ vàng là curcumin [51]. Dịch chiết hoàng bá nam/EtAc xuất hiện 2 băng màu nâu đen, với hệ số Rf = 0,6 và Rf = 0,8 (hình 3.8a), các chất này có thể thuộc nhóm sterol.
Bên cạnh những dịch chiết chứa chất chuẩn có hoạt tính ức chế vi khuẩn mạnh, một số dịch chiết không phát hiện dấu vết của cả 3 chất chuẩn sàng lọc và không gây tan máu nhưng có hoạt tính mạnh như dịch chiết lá trầu không. Trên sắc ký đồ (hệ dung môi TEAF-5:3:1:1) có thể nhận thấy dịch chiết trầu không trong EtAc và Met đều có 1 băng rất lớn, dưới ánh sáng thường có màu xám đậm, hệ số Rf = 0,71 (Hình 3.8c). Nghiên cứu cần thực hiện thêm thí nghiệm để xác định mối liên hệ giữa những băng chất rất lớn này với hoạt tính ức chế vi khuẩn H. pylori.
Từ các kết quả nghiên cứu trên, những dịch chiết có hoạt tính mạnh, chứa hàm lượng lớn chất khác ngoài chất chuẩn đồng thời không có khả năng gây tan máu như trầu không/Met, đỗ rừng/EtAc, quế chi/EtAc là những dịch chiết tiềm năng được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo để tìm ra chất mới kháng H. pylori.