1.3.1. Các loại chỉ thị và dấu chuẩn trong nghiên cứu thực vật
Ng y n y, trên thế gi i, nh m thu nguồn g từ thảo mộ ng y ng qu n t m ph t tri n nh v o t nh n to n ũng nh l i thế v hi ph sản xuất ủ h ng. Thị tr ng thế gi i v thu nguồn g thảo mộ , o gồm ả liệu th , t nh ạt trung nh 62 tỷ l M một n m. Ư t nh ến n m 2050, o nh thu ủ thị tr ng n y th ạt ến 5000 tỷ l M (K lp n , 2004). Trong ho n ảnh , việ hứng minh s kho họ v tiêu huẩn ho ng nghệ o hế thu từ thảo v i tr hết sứ qu n trọng. C sản phẩm từ thảo th ng kém ổn ịnh v th nh phần v t nh, tr i ng v i sản phẩm t n tổng h p nh n tạo từ ho hất tinh khiết v quy tr nh ng nghệ ổn ịnh. Ch nh v v y, ng t ki m ịnh v ảm ảo hất l ng nguồn nguyên liệu n ầu l yêu ầu thiết yếu tạo loại thu nguồn g thảo v i hất l ng ổn ịnh v n to n.
Việ nhầm l n lo i thảo v i nh u trong qu tr nh thu h i, hế iến v sử ụng l hiện t ng h y gặp, o trong t nhiên th tồn tại nhi u lo i h nh th i t ng t kh ph n iệt. Thêm n , trong nhi u n n y họ ổ truy n kh nh u, một y liệu th gọi ằng nhi u tên kh nh u hoặ y liệu kh nh u lại tên tr ng nh u. V v y, yêu ầu tr tiên i v i ng nh ng nghiệp hế iến thu từ thảo l phải x ịnh h nh x nguồn nguyên liệu n ầu. C nhi u ph ng ph p ịnh loại y liệu, nh sử ụng hỉ thị ảm qu n (h nh th i, m u s , m i, vị...) v hỉ thị ho họ ... Trong , hỉ thị h họ th ng sử ụng l k thu t s k (s k l p m ng - TLC, s k l p m ng o p - HPTLC, s k kh , s k ột, s k l ng o p - HPLC...) và các ph ng ph p kh i phổ. Cả ph ng ph p sử ụng hỉ thị h nh th i v hỉ thị h họ
19
u nh ng u i m nổi t nhất ịnh. Song i v i liệu v y thu l lo i ng hi (genus) hoặ ng lo i nh ng kh thứ (v r.) th h i ph ng ph p trên sẽ kh ph n iệt h nh x .
S ph t tri n ủ ng nghệ sinh họ ung ấp thêm nh ng ng ụ m i ho ng t ịnh loại thảo trên hỉ thị ADN. Nh ng hỉ thị ADN th ng ng th k ến l RFLP (Restri te Fr gment Length Polymorphism), RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA), RFLP-PCR, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repe t)... C hỉ thị ADN nhi u l i thế ng k so v i hỉ thị ảm qu n hoặ ho họ v n hầu nh kh ng ị ảnh h ng i yếu t m i tr ng, ngoại ảnh, tuổi y h y t nh trạng sinh l khi thu h i... Đồng th i, sử ụng hỉ thị ADN n th nh gi mứ ộ ạng i truy n trong lo i y thu . Nh v y, sử ụng hỉ thị ADN tr hết sẽ gi p ho việ ph n t h h nh x các loài cây thu h y gi loại liệu g y nhầm l n. H n n , v i việ nh gi v mứ ộ ạng i truy n trong lo i n l s họn tạo gi ng y thu n ng suất o, ũng nh trong việ ảo tồn h nh x nguồn gen quý.
1.3.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng các trình tự ADN bảo thủ trong phân tích quan hệ phát sinh ở thực vật
Hệ th ng h l qu tr nh th m , m tả v giải th h t nh ạng ủ thế gi i sinh v t. V o n m 1758, Linn eus x y ng hệ th ng ph n loại m ng t nh thứ t tr khi ph t tri n họ thuyết tiến h . S xuất hiện v ph t tri n ủ k thu t ph n tử m ặ iệt l phản ứng hu i polymer h - PCR h nh th nh nên một l ng l n liệu sẵn s ng ho việ giải tr nh t ADN v k thu t l m nảy sinh ADN fingerprint. T nh phổ iến ủ liệu ph n tử trên Gen nk hiện n y cho phép m rộng ph n t h r t xon kh ngo i t xon thu m u. Nhi u ạng ặ i m m ng t nh th ng tin, ặ iệt l tr nh t ADN ứng ụng trong nghiên ứu m i qu n hệ ph t sinh v qu tr nh tiến h th
20
v t. C th v t o m ng trong n ộ gene: ộ gene trong nh n, ộ gen ty th v ộ gen lạp th . Tỷ lệ th y thế nu leoti e ộ gen n y xảy r kh ng ồng u [53]. Tỷ lệ th y thế nu leoti e m i ộ gen nh gi th ng qu việ qu n s t th y thế nu leoti e h ng loạt th v t một v h i l mầm [78]. Bộ gene ty th mứ ộ th y thế nu leoti thấp nhất, trung nh khoảng (0,2 - L,l) X 10-9 th y thế ho một vị tr trong một n m. Bộ gene lạp th mứ ộ th y thế nh nh h n h t t, khoảng (1,1 - 2,9) X 10-9 thay thế ho một vị tr trong một n m. Tr i lại, ộ gene trong nh n tỷ lệ th y thế nu leoti e nh nh h n gấp 150 lần so v i ộ gene ty th ( ến 31,5 X 10-9) th y thế ho một vị tr trong một n m [45].
Tỷ lệ th y thế nu leoti e th v t kh v n ản so v i s tiến hóa nhanh chóng ủ ph n tử ty th ộng v t. Trong lị h sử t ng i ng n ủ hệ th ng họ ph n tử, l ầu nh nghiên n t p trung nhi u v o ộ gene lụ lạp,v s u huy n h ng s ng tr nh t gen trong nh n [70].
+ Bộ gen lụ lạp: Bộ gen lụ lạp ủ s th v t trên ạn th ng th ng ặ tr ng i ph n tử ạng v ng. Bộ gene n y é nhất trong s ộ gen, khoảng 135-160k v i h i ph n oạn lặp ảo [inverte repe t (IR) segments]
hi phần ph n tử n lại th nh một v ng LSC (l rge single- opy region) v một vùng ssc (small single-copy region) [51]. Th nh phần, k h th , ấu trúc và trình t ủ ộ gene lụ lạp x ịnh l mứ ộ ảo thủ o trong các nghiên ứu v tiến h . T nh ảo thủ o n y hỉ r rằng ất k th y ổi n o v ấu tr , h s p x p h y th nh phần u liên qu n mạnh mẽ ếnqu n hệ ph t sinh. C phần kh nh u ủ ộ gene tiến h theo tỷ lệ kh nh u v t ng i h m mứ ộ tr nh t nu leoti e. Nh ng v ng kh ng m h ủ ộ gene lụ lạp tiến h nhanh h n nh ng v ng m h [78]. C ột iến t ng oạn h y mất oạn t h lũy trong vùng kh ng m ng m xảy r v i tỷ lệ ng ng v i s th y thế nu leoti e v h nh ki u ột iến n y l m t ng ng t nh ạng ủ v ng kh ng m ng m . T nh ảo thủ o ủ ADN lụ lạp th s l u thế khi sừ ụng n x y ng m i qu n hệ ph t sinh v qu tr nh tiến h mứ ộ từ lo i ến hi v ến họ th v t [70]. C th thấy nh ng v ng tr nh t lụ lạp th ng sử ụng trong
21
nghiên ứu qu n hệ ph t sinh th v t gồm: gene rbcL, gene atpB,16S rRNA, gene matK và vùng tr nh t kh ng m h th ng trnL-V [69, 70].
Gen matK là gen mã hóa cho protein s tiến h nh nh nằm trên v ng LSC v i ộ i xấp xỉ 1500 p, ồng phiên m v i gen trnK [31]. Gen matK gồm 1 oạn ORF hứ 509 o on nằm trong intron ủ gen matK v ng nh h rõ hứ n ng. C nghiên ứu sử ụng tr nh t gen matK x y d ng y ph t sinh ho thấy gen matK t nh ạng h n nh ng gen khác có trong lụ lạp, o tr thành gen m rker qu n trọng gi p ph n loại th v t. B i gen matK th ễ ng khuế h ại ng v i v ng intron kh ng m ng m h i ầu ủ n , m rộng tr nh t lên ến 2400-2700 p nên việ sử ụng v ng n y ứng ụng nhi u trong nghiên ứu qu n hệ ph t sinh gi lo i v trong một lo i [69]. Mặt khác, một phần gen matK ũng th ng sử ụng x y ng qu n hệ ph t sinh [84].
+ C tr nh t ảo thủ ộ gene trong nh n: Bộ gene trong nh n k h th l n nhất trong s ộ gen th v t (1,1 X 106 ến 110 X 106 k p) v o gồm rất nhi u gen. Phần l n n l nghiên ứu v qu n hệ ph t sinh ằng hỉ thị ph n tử sử ụng tr nh t ADN ri osome trong nh n, ấu tr n ản ủ ADN ri osome l một n vị lặp n, m i n vị nh thế th lặp lại ến h ng ng n lần trong ộ gen. Bộ gen trong nh n hứ một v ng s o m ấu tr o gồm khoảng tr ng ên ngo i v ng s o m (ETS), tiếp theo l gen 18S m h ho ti u n vị nh và gen 26S mã h ho ti u n vị l n v n ph n h nh u i một gen nh h n là 5,8S. C khoảng tr ng trong v ng phiên m (ITS1 v ITS2) t h r i nh ng gen vừ p. Chi u i ủ v ng m ng m l gi ng nh u th v t: gen 18S l khoảng 1800 p, 26S l khoảng 3300 p v gen 5,8S l khoảng 160 p. Họ gen rRNA hứ v ng ảo thủ o nh 18S, 26S th sử ụng suy lu n qu n hệ ph t sinh mứ ộ ph n loại o. C oạn tiến h nh nh nh v ng ITS th l thích h p nhất trong so s nh lo i v nh ng hi gần nh u. C tr nh t 18S rRNA th ng sử ụng rộng rãi h n tr nh t 26S cho ả h i v ng ng ải ứng ụng rộng nh nh u. K h th trên 3000 p ủ 26S rRNA ản tr việ sử ụng n , ặ iệt l trong việ giải tr nh t
22
to n ộ gen. Tr i lại, k h th ủ 18S rRNA khoảng 1800 p gi p ho n u tiên l họn h n khuế h ại ằng PCR v giải tr nh t . Th tế ho thấy y qu n hệ ph t sinh sử ụng tr nh t 18S rRNA kh ồng ạng v i y qu n hệ ph t sinh sử ụng tr nh t rbcL nhi u mứ ộ ph n loại th v t hạt k n [69]. Gen 5,8S rRNA ễ ng khuế h ại v giải tr nh t khi sử ụng mồi ịnh vị trên gen 18S v 26S rRNA nh ng t khi sử ụng suy lu n qu n hệ ph t sinh i t nh ảo thủ o v k h th é (164-165 p). Tỷ lệ vị tr m ng th ng tin ti m n ng ho ph n t h qu n hệ ph t sinh t ng ng v i gen 18S rRNA.
V ng ITS: ITS1 ph n h gen 18S rRNA v i gen 5,8S rRNA còn ITS2 phân h gen 5,8S rRNA v i gen 26S rRNA. Vùng ITS hiện h u một h rộng r i i 700 p th v t ho . C rất nhi u mồi tổng th thiết kế ho việ khuế h ại v giải tr nh t v ng ITS m tả. C tr nh t ITS v n gi u GC l m ho việ giải tr nh t tr nên kh kh n [26]. Việ ho thêm DMSO h y BSA v o PCR h y phản ứng giải tr nh t m ng lại hiệu quả o [77]. C tr nh t ITS ạng h n tr nh t ủ gen rRNA th v t hạt k n [82]. C tr nh t ITS iến ộng một h hiệu quả ho phép giải quyết nh ng u h i v qu n hệ ph t sinh nh ng t xon qu n hệ họ h ng gần. C tr nh t ITS sử ụng rất th nh công trong việ x y ng lại lị h sử tiến h .
1.3.3. Các phương pháp xây dựng cây quan hệ phát sinh
C y qu n hệ ph t sinh x y ng nhằm m h nh h lị h sử tiến h ủ một nh m tr nh t h y sinh v t. Việ t i hiện m i qu n hệ ph t sinh th th hiện ằng ph ng ph p trên khoảng h i truy n hoặ trên ặ i m nh tr nh y s u y:
+ C c phương pháp dựa trên khoảng c ch
H i thu t to n th ng ụng trên so s nh khoảng h theo ặp l Ph ng ph p l p nh m kh ng trọng s ng trung nh s họ (UPGMA - unweighted PairGroup Method using arithmetic Averages) [68] v Gom ụm l n n (Neigh or joining) [63]. B ầu tiên trong phép ph n t h n y l t nh to n x y ng m
23
tr n khoảng h theo ặp gi n vị ph n loại khảo s t th ng qu ặ i m kh nh u v tr nh t ủ h ng. Đ hiệu hỉnh, th ng th ng ng i t sử ụng hiệu hỉnh khoảng h ằng một m h nh tiến h n o , hẳng hạn nh mô hình Jukes-Cantor, mô hình Felsentein, m h nh h i th ng s ủ Kimur , m h nh Tamura, mô hình Tamura và Nei.
Phương pháp UPGMA
UPGMA l thu t to n n giản nh ng phổ iến nhất i v i liệu khoảng cách [58]. Ph ng ph p n y v o nguyên l l trên s khoảng h gi từng ặp tr nh t , i u iễn th nh ạng m tr n khoảng h ( ạng i xứng), từ m tr n n y, lần l t t m ặp ụm gần nh u v o tiêu h khoảng cách gi h ng l nh nhất . M tr n khoảng h D = ( ij) l m tr n trong m i phần từ ij l khoảng h gi 2 n t l trong y qu n hệ ph t sinh. Khoảng h gi n t l v n t ên trong y ũng hỉ rõ. Khoảng h ij trong ng ảnh tiến h th m n cá i u kiện s u y:
- T nh i xứng: ij = ji v i mọi i, j
- T nh ph n iệt: ij ≠ 0 nếu v hỉ nếu i ≠ j
- Bất ẳng thứ t m gi : ij < ik + kj v i mọi i, j, k Phương pháp Neighbor joining
Thu t to n Neigh or joining sử ụng trong ph ng ph p n y xây ng y qu n hệ ph t sinh m tỷ lệ tiến h t nh t o v kh nh u gi ng kh nh u. Ph ng ph p Neigh or joining ũng t ng t nh ph ng ph p gom ụm UPGMA, tuy nhiên kh i niệm ụm l n n (gần nh u) kh i khi m h i tr nht gọi l l n n trong một y nếu nh gi h ng hỉ uy nhất một n t. Đi un y th hiện nhằm ki m so t t nh hu ng h i n t gần nh u nhất kh ngphải l l n n nh u trong y th t. Neigh or joining xem l ph ng ph p kh t tv sử ụng rộng r i. C thu t to n trong ph ng ph p
24
ho n thiện gi p hoviệ việ xử l t p h p liệu l n tr nên ễ ng h n [63].
+ Các phương ph p dựa trên đặc tính
Trong khi ph ng ph p trên khoảng h th ng tin tr nh t th nhmột on s n ( i u iễn khoảng h) th ph ng ph p trên ặ t nh lại g ng suy lu n m i qu n hệ ph t sinh trên to n ộ ặ t nh riêng lẽ nh nucleotid hay amino acid.
Phương pháp Giản tiện tối đa (Parsimony)
Ở ph ng ph p trên nguyên l giản tiện t i , một s l ng vị tr x ịnh l m ng th ng tin v h nh th ủ y qu n hệ ph t sinh. D v o ,h nh th t t nhất họn r v o việ giảm thi u h s l ng vị tr th y thế ần thiết giải th h vị tr m ng th ng tin. C ph ng ph p trên nguyên lý giản tiện t i kh ng trên suy lu n m h nh hi n h [49].
Phương pháp khả năng đúng cao nhất (Maximum likelihood)
H i ph ng ph p M ximum likelihoo v B yesi n l nh ng ph ng ph p suy lu n v o x xuất [30]. Cả h i ph ng ph p n y ặ i m th m n việ sử ụng m h nh suy lu n v tiến h ph n tử v ho phép r suy lu n m ng t nh th ng kê nghiêm ngặt. Cả h i ph ng ph p n y i h i phải huyên s u v m y t nh. V i ph ng ph p M ximum likelihoo , một m h nh iến ộng v tiến h ph n tử sử ụng ấn ịnh khả n ng ng m ng t nh x xuất trong m i qu n hệ ph t sinh i v i liệu tr nh t ủ n vị ph n loại ho tr . Suy lu n khả n ng ng o nhất v o t m r y qu n hệ ph t sinh x xuất o nhất i v i liệu [40].
Suy luận Bayesian
Ph ng ph p suy lu n B yesi n trên quy lu t B yes. Mụ tiêu ủ ph ng ph p suy lu n B yesi n v qu n hệ ph t sinh kh ng hỉ l suy lu n r một qu n hệph t sinh ng m h n n l nh n ầy ủ ph n x xuất v s u i v ito n ộ qu n hệ ph t sinh khả . Đi u n y l nh s kết h p
25
khả n ng ng v i ph n x xuất n ầu ủ th ng s v tiến h . Một l ng rất l n y qu n hệ ph t sinh khả r , ồng ngh v i phân t h qu n hệ ph t sinh B yesi n ần phải th hiện i ph ng ph p d trên thu t to n Monte C rlo [81].
Nh v y từ khi t ầu ghi nh n Việt N m ho t i n y, s l ng lo i v i lo i trong chi Panax L. nhi u th y ổi. Đi m qu tất ả nghiên ứu ến th i i m hiện tại th Việt N m lo i v i lo i thuộ hi Panax L. gồm : T m thất (Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen) (lo i nh p trồng); T m thất ho ng (Panax stipuleanatus C. T. Tsai & K. M. Feng); S m ngọ linh (Panax vietnamensis var. vietnamensis Ha et et Grushv.); Sâm lai châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai) và Sâm Langbian (Panax vietnamensis var. langbianensis N.V. Duy, V.T Tran & L.N. Trieu). Ngoài r n h i t xon h h h n v tên kho họ l t xon v n gọi l S m vũ iệp v i h nh th i gi ng T m thất ho ng (Panax stipuleanatus C. T. Tsai & K. M.
Feng), tr nh nhầm l n v i lo i Panax bipinnatifidus Seem. chúng tôi tạm gọi l T m thất l xẻ - Panax sp.1. T xon n lại ph n n i Pux il ileng thuộ huyện K S n tỉnh Nghệ An gọi v i tên S m pux il ileng, h ng t i tạm gọi l Panax sp.2. Các loài thứ lo i thuộ hi Panax L. Việt N m u l nh ng y thuộ iện hiếm gặp, v k h th quẩn th nh trên thế gi i ũng nh Việt N m. Đ y l nh ng y thu gi trị sử ụng v gi trị kinh tế o. V thế h ng ị s n t m v kh i th qu mứ . Đ l một trong nh ng nguyên nhân làm cho lo i thứ lo i k trên xếp v o iện k nguy ấp th m h th tuyệt hủng ngo i thiên nhiên (S m ngọ linh). V i mụ tiêu ung ấp nh ng s v n liệu kho họ phụ vụ ng t ảo tồn v ph t tri n các loài Sâm Việt Nam, ũng nh ng t ịnh nh, ph n iệt các lo i S m ễ nhầm l n, v ki m ịnh liệu ủ loài Sâm này, chúng t i l họn t i Nghiên cứu đặc điểm hình th i, giải phẫu và chỉ thị sinh học phân tử một số oài thuộc chi Sâm (Panax L.) mọc tự nhiên ở Việt Nam.
26