Nghiên cứu chỉ thị phân tử và mối quan hệ di truyền của c c mẫu thu thập với c c taxon trong cùng chi Panax L

Chương 2. MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

3.4. Nghiên cứu chỉ thị phân tử và mối quan hệ di truyền của c c mẫu thu thập với c c taxon trong cùng chi Panax L

3.4.1. Tách chiết ADN tổng số và khuếch đại vùng gen ITS-rDNA và matK

Bằng h sử ụng Dneasy plant mini kit t h hiết ADN tổng s từ 35 m u l trong nghiên ứu, kết quả ầu ghi nh n th ng qu iện i nh s u: tất ả m u u qu n s t một ng ADN tổng s v i k h th t ng ứng v i ng 23.1 k ủ m rker, ng rõ nét hứng t nồng ộ ADN thu kh o, t ứt g y v ủ i u kiện tiếp tụ th hiện th nghiệm tiếp theo.

80

Ki m tr hất l ng ADN tổng s ằng ph ng ph p o qu ng, nồng ộ ADN tổng s ủ 35 m u, kết quả o nồng ộ ADN tổng s thu kh o, nằm trong khoảng từ 35 - 123 ng/àl ho thấy hiệu suất t h hiết t t. Độ tinh sạ h th hiện qu hỉ s A260 280 nằm trong gi trị từ 1,7 – 2,5.

S u khi PCR ặ hiệu v i mồi ủ h i gen ITS – rDNA và matK, sản phẩm PCR iện i (H nh 3.4, 3.5), kết quả ho thấy h ng t i khuế h ại thành công vùng gen ITS-rDNA dài 0,7 kp và oạn gen matK dài 1,2 kb ủ 35 m u Panax. C ng s ng, rõ r ng hứng t hiệu quả khuế h ại t t.

Hình 3.72. Kết quả iện di sản phẩm PCR gen ITS - rDNA của các m u nghiên cứu

Hình 3.73. Kết quả iện di sản phẩm PCR gen matK của các m u nghiên cứu 3.4.2. Phân tích và giải trình tự vùng gen ITS-rDNA và matK

3.4.2.1. Kết quả p ân tíc trìn tự nucleot de vùn en ITS-rDNA

0,7 Kb

1,2 Kb

81

S u khi hỉnh sử v loại mồi, v ng gen ITS-rDNA ủ 35 m u thu hi u i từ 702 ến 715 p. Tiến h nh ki m tr v so s nh tr nh t nu leoti e ủ m u thu một s kết quả nh s u:

(1). So s n trìn tự nucleot de đoạn en ITS-rDNA ữa c c mẫu Tam t ất oan v Tam t ất l xẻ

Khi so s nh kết quả giải tr nh t oạn gen ITS-rDNA ủ m u T m thất hoang (Panax stipuleanatus) v T m thất l xẻ (Panax sp.1), h ng t i nh n thấy kết quả ph n th nh h i nh m, trong , nh m 1 gồm m u thu th p tại H Gi ng gồm m u P29, P.30, P.32 x ịnh thuộ lo i Panax stipuleanatus, và m u P.21, P.22, P.23 v P.24 ủ t xon Panax sp.1, ả 7 m u n y u ho kết quả giải tr nh t oạn gen ITS-rDNA t ng ồng nh u 100%. Nh m 2 gồm m u thu th p tại S P , L o C i gồm m u P.28, P.33 thuộ Panax stipuleanatus v m u P.20, P.25 ủ Panax sp.1, ả 4 m u n y ho kết quả giải tr nh t oạn gen ITS-rDNA t ng ồng nh u 100%. Gi nh m 1 v nh m 2 s kh iệt nh u 1 vị tr nu leoti e s 427 ụ th nh s u:

Bảng 3.1. Vị trí khác biệt trình t oạn gen ITS của các m u P. stipuleanatus và Panax sp.1 và các m u loài P. stipuleanatus trên genbank

Taxon Ký hiệu mẫu Điểm thu thập Vị trí

472 P. stipuleanatus P29, P.30, P.32 Hoàng Su Phì, Hà Giang C

P. stipuleanatus P.28, P.33 Sa Pa, Lào Cai T

Panax sp.1 P.21, P.22, P.23, P.24 Hoàng Su Phì, Hà Giang C

Panax sp.1 P.20, P.25 Sa Pa, Lào Cai T

P. stipuleanatus JX680330 Sa Pa, Lào Cai T

P. stipuleanatus HQ112441 V n N m, Trung Qu T

P. stipuleanatus HQ112442 Sa Pa, Lào Cai T

82

P. stipuleanatus HQ112443 Khun H , T m Đ ng, L i

Châu T

P. stipuleanatus HQ112444 Quảng N m, Việt N m T P. stipuleanatus KX768323,KX768324,

KJ418197, KJ418198

Hồ Thầu/ Khun Há, Tam

Đ ng, L i Ch u C

(2). So s n trìn tự nucleot de đoạn en ITS-rD A ữa c c mẫu Sâm n ọc l n Sâm lai châu, Sâm puxailaileng và Sâm langbian

Kết quả giải tr nh t v ng gen ITS-rDNA ủ m u ho thấy 16 m u S m ngọ linh (P.01 – P.16) tr nh t nu leoti e t ng ồng 100%. Trong khi , n m m u S m l i h u (P.35 – P.39) v 2 m u S m pux il ileng (P.40, P.41) tr nh t nu leoti e t ng ồng nh u 100%.

So s nh tr nh t nu leoti e oạn gen ITS-rDNA gi S m ngọ linh, S m l i châu, Sâm puxailaileng và Sâm langbian nh n thấy, gi S m l i h u v S m pux il ileng so v i S m l ng i n hỉ kh nh u 1 vị tr nu leoti e s 600. S m l ng i n ph n iệt v i S m ngọ linh 5 vị tr nu leoti e s 219, 386, 467, 534 v 564. V S m l i h u ng v i s m pux il ileng kh iệt v i S m ngọ linh 6 vị tr nu leoti e vị tr 219, 386, 467, 534, 564 v 600. S s i kh hi tiết th hiện ảng 3.2:

Bảng 3.2. Vị trí khác biệt trình t oạn gen ITS-RDNA của các m u Sâm ngọc linh, Sâm lai châu, Sâm puxailaileng và Sâm langbian

Taxon Ký hiệu

mẫu Nơi ấy Vị trí

219 386 467 534 564 600 P. vietnamensis P.01 - P.16

Quảng Nam và Kon Tum

A G C C G T

P. vietnamensis

var. fuscidiscus P.35 – P.39 Lai Châu G A T A A C Panax sp.2 P.40, P.41

Pu Xai Lai Leng, Nghệ An

G A T A A C

P. vietnamensis

var. langbianensis KX768322

Lạ D ng, L m Đồng

G A T A A T

83 Taxon Ký hiệu

mẫu Nơi ấy Vị trí

219 386 467 534 564 600 P. vietnamensis KX768325 Đ k Gley

Kon Tum A A T C G C

P. vietnamensis var. fuscidiscus

KJ418182, KJ418184, KJ418186, KJ418187, KJ418183, KJ418185, KJ418188, KJ418189, KJ418190, KJ418191, KJ418192, KX768326

Lai Châu G A T A A C

P. vietnamensis var. fuscidiscus

KJ418193, KJ418194, KJ418195

Trà Linh, Nam Trà My, Quảng Nam

A G C C G C

(3). So s n trìn tự nucleot de đoạn en ITS-rD A ữa c c lo t u c c Panax ở V ệt am

Tổng h p kết quả giải tr nh t oạn gen ITS-rDNA ủ lo i thứ lo i trong nghiên ứu gồm P. notoginseng, P. stipuleanatus, Panax sp.1, Panax sp.2, Panax sp.2 và P. vietnamensis var. fuscidiscus so v i tr nh t lo i thuộ hi Panax ng trên Gen nk. S s i kh tr nh t nu leoti e gi lo i thứ lo i tổng h p nh s u:

Bảng 3.3. Nh ng vị trí khác biệt trình t oạn gen ITS-rDNA của các loài/thứ loài nghiên cứu v i các loài thuộc chi Panax

Taxon Vị trí

16 37 45 59 62 70 72 85 105 106 117 Các

taxon nghiên

P. notoginseng (1) C A T T G T G G C G G P. stipuleanatus (2) C C C C A C A A T A T Panax sp.1 (3) C C C C A C A A T A T

84

ứu Panax sp.2 (4) C C T C G C A G C G G P. vietnamensis (5) T C T C G C A G C G G P. vietnamensis

var. fuscidiscus

(6) C C T C G C A G C G G

Các taxon thu th p trên genbank

P. vietnamensis var.

langbianensis

(7) C C T C G C A G C G G

P. bipinnatifidus (8) C C T C G C A G C G G P. quinquefolius (9) T C T C G C A G C G G P. japonicus (10) T C T C G C A G C G G P. pseudoginseng (11) C C C C A C A G C G G P. ginseng (12) T C T C G C A G C G G P. trifolius (13) C C C C A C A C C G G

Taxon

Vị trí

118 119 169 178 189 207 219 317 386 406 408 409 412 419

(1) C C T A C A A T G C A T T G

(2) T C C A T G A C G C C G C A

(3) T C C A T G A C G C C G C A

(4) C T C T C A G C A T A T C A

(5) C T C T C A A C G T A T C A

(6) C T C T C A G C A T A T C A

(7) C T C T C A A C A T A T C A

(8) C T C A C A A C A C A T C G

(9) C T C A C A A C G C A T C A

(10) A T C A C A A C G C A T C G

(11) C T C A C A A C G C A T C A

(12) A T C A C A A C G C A T C G

(13) C T C A C T A C G C C G C A

Taxon Vị tr

85

420 430 446 467 498 511 524 534 564 566 591 594 598 600

(1) C T A C T A T C G A T C G C

(2) T G T C C T A C A G C T A C

(3) T G T C C T A C A G C T A C

(4) C G T T T A A A A A C C G C

(5) C G T C T A A C G A C C G T

(6) C G T T T A A A A A C C G C

(7) C G T C T A A A G A C C G T

(8) C G T C T A A C G A C C G C

(9) C G T C T A A C G A C C G C

(10) C G T C T A A C G A C C G C

(11) C G T C T A A T T A A C G C

(12) C G T C T A A C G A C C G C

(13) C G C C C A A C G A C C G C

Từ kết quả tổng h p trên, th thấy v o tr nh t oạn gen ITS-rDNA th ph n iệt lo i T m thất (Panax notoginseng (Burkill) v lo i T m thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. S i, K.M. Feng) 32 vị tr nu leoti e v ph n iệt v i S m ngọ linh 17 vị tr nu leoti e. Lo i T m thất ho ng (Panax stipuleanatus H.T. Sai, K.M. Feng) kh iệt v i lo i S m ngọ linh (Panax vietnamensis) 23 vị tr nu leoti e v kh iệt v i thứ S m l i h u v thứ S m l ng i n 24 vị tr nu leoti e. Qu y ũng nh n thấy, T m thất ho ng v T m thất l xẻ kh iệt v i S m vũ iệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 21 vị tr nu leoti e trên oạn gen ITS- rDNA. Nh ng kết quả trên y ho thấy v ng gen ITS-rDNA th hiện ti m n ng l n trong việ ph n iệt t xon ủ hi Panax L.

3.4.2.2. Kết quả p ân tíc trìn tự AD vùn en matK

S u khi hỉnh sử v loại mồi, v ng gen matK ủ m u Panax thu có hi u i nằm trong khoảng 1061 ến 1104 p. So s nh tr nh t nu leoti e ủ m u nghiên ứu v tr nh t ng trên Gen nk nh n thấy một s kết quả kh iệt nh s u:

86

(1). So s n trìn tự nucleot de đoạn en matK ữa c c mẫu Tam t ất oan v Tam t ất l xẻ

Cũng gi ng v i kết quả giải tr nh t oạn gen ITS-rDNA, kết quả giải tr nh t oạn gen matK ủ m u T m thất ho ng (Panax stipuleanatus) v T m thất l xẻ (Panax sp.1), ũng ph n th nh h i nh m riêng iệt theo v ng ph n , trong , nh m 1 gồm m u thu th p tại H Gi ng gồm m u P29, P.30, P.32 x ịnh thuộ lo i Panax stipuleanatus, v m u P.21, P.22, P.23 v P.24 ủ t xon Panax sp.1, ả 7 m u n y u ho kết quả giải tr nh t oạn gen matK t ng ồng nh u 100%. Nh m 2 gồm m u thu th p tại S P , L o C i gồm m u P.28, P.33 thuộ Panax stipuleanatus v m u P.20, P.25 ủ Panax sp.1, ả 4 m u n y ho kết quả giải tr nh t oạn gen matK t ng ồng nh u 100%. Gi nh m 1 v nh m 2 s kh iệt nh u 1 vị tr nu leoti e s 462 (Bảng 3.6).

Tr nh t nu leoti e oạn gen matK gi m u T m thất ho ng v T m thất l xẻ thu th p tại Ho ng Su Ph , H Gi ng kh iệt v i m u Panax stipuleanatus ph n tại i m L o C i, L i Ch u, Quảng N m v V n N m, Trung Qu ng vị tr nu s 462 (Bảng 3.4). Việ th y thế T ằng G vị tr nu leoti e s 462 trên oạn gen matK th oi l s ạng i truy n quần th ph n khác nhau.

Bảng 3.4. Nh ng vị trí khác biệt trình t oạn gen matK của các m u P.

stipuleanatus và Panax sp.1 và các m u loài P. stipuleanatus trên genbank

Taxon Ký hiệu mẫu Điểm thu thập Vị trí

462 P. stipuleanatus P.29, P.30, P.32 Hoàng Su Phì, Hà

Giang G

Panax sp.1 P.21, P.22, P.23, P.24 Hoàng Su Phì, Hà

Giang G

P. stipuleanatus P.28, P.33 Sa Pa, Lào Cai T

Panax sp.1 P.20, P.25 Sa Pa, Lào Cai T

P. stipuleanatus JX680328 Sa Pa, Lào Cai T

P. stipuleanatus HQ113079 Vân Nam, Trung

Qu T

P. stipuleanatus HQ113080 Sa Pa, Lào Cai T

87

P. stipuleanatus HQ113082 Quảng N m, Việt

Nam T

P. stipuleanatus

HQ113081, KX768329, KX768330, KJ418213, KJ418214, KJ418215

Lai Châu T

(2). So s n trìn tự nucleot de ữa c c mẫu Sâm n ọc l n Sâm la c âu Sâm puxailaileng và Sâm langbian

So s nh tr nh t nu leoti e ủ m u nh n thấy, 16 m u S m ngọ linh (P.01 – P.16) tr nh t nu leoti e gi ng nh u ho n to n, m u S m l i h u v S m pux il ileng gi ng nh u 100%. Trong khi , m u S m ngọ linh ph n iệt v i S m l i h u v S m pux il ileng 2 vị tr nu leoti e 903 v 1096 ( ụ th Bảng 3.5).

Bảng 3.5. S sai khác trình t nucleotide oạn gen matK gi a Sâm ngọc linh, Sâm lai châu, Sâm puxailaileng và Sâm langbian

Taxon Ký hiệu mẫu Điểm thu thập Vị trí

903 1096 P. vietnamensis P.01 - P.16 Quảng N m v Kon

Tum G T

P. vietnamensis

var. fuscidiscus P.35 – P.39 Lai Châu A T

Panax sp.2 P.40, P.41 Pu Xai Lai Leng,

K S n, Nghệ An A T

P. vietnamensis

var. langbianensis KX768328 Lạ D ng, Lâm

Đồng G A

P. vietnamensis KX768331 Đ k Gley, Kon Tum G T

P. vietnamensis var. fuscidiscus

KJ418211, KJ418211, KJ418201, KJ418209, KJ418199, KJ418200, KJ418203, KJ418207, KJ418210, KX768332

Lai Châu A T

P. vietnamensis var. fuscidiscus

KJ418204, KJ418205, KJ418206

Trà Linh, Nam Trà

My, Quảng N m A T

(3). So s n trìn tự nucleot de đoạn en matK ữa c c lo t u c c Panax ở V ệt am

88

Tổng h p kết quả giải tr nh t oạn gen matK ủ lo i thứ lo i trong nghiên ứu gồm P. notoginseng, P. stipuleanatus, Panax sp.1, Panax sp.2, Panax sp.2 và P. vietnamensis var. fuscidiscus so v i tr nh t lo i thuộ hi Panax ng trên Gen nk. S s i kh tr nh t nu leoti e gi lo i thứ lo i tổng h p nh s u:

Bảng 3.6. Nh ng vị trí khác biệt trình t oạn gen matK của các loài/thứ loài nghiên cứu v i các loài thuộc chi Panax

Taxon

Vị trí

107 108 196 216 217 226 256

Các taxon nghiên ứu

P. notoginseng (1) A G A A A C A

P. stipuleanatus (2) C T T A A A A

Panax sp.1 (3) C T T A A A A

Panax sp.2 (4) A G A G G C G

P. vietnamensis (5) A G A G G C G

P. vietnamensis var.

fuscidiscus (6) A G A G G C G

Các taxon thu th p trên Genbank

P. vietnamensis var.

langbianensis (7) A G A G G C G

P. bipinnatifidus (8) A G A G G C G

P. quinquefolius (9) A G A G G C G

P. japonicus (10) A G A G G C G

P. pseudoginseng (11) A G A G G C G

P. ginseng (12) A G A G G C G

P. trifolius (13) A G A G G C G

Taxon

Vị trí

300 431 462 466 473 561 635 703 712 728

(1) G C G C C C G C T T

(2) T A T T C T T A A C

(3) T A T T C T T A A C

(4) G C G C C C G A T T

(5) G C G C C C G A T T

89 Taxon

Vị trí

300 431 462 466 473 561 635 703 712 728

(6) G C G C C C G A T T

(7) G C G C C C G A T T

(8) G C G T C C G A T T

(9) G C G C C C G A T T

(10) G C G T C C G A T T

(11) G C G C A C G A T T

(12) G C G T C C G A T T

(13) G C G T C C G A T T

Taxon

Vị trí

733 830 842 903 914 944 1024 1037 1088 1096

(1) G A A A C G G G C T

(2) T C C A A A T T A T

(3) T C C A A A T T A T

(4) G C A A C G G G C T

(5) G C A G C G G G C T

(6) G C A A C G G G C T

(7) G C A G C G G G C A

(8) G C A A C G G G C T

(9) G C A A C G G G C T

(10) G C A A C G G G C T

(11) G C A A C G G G C T

(12) G C A A C G G G C T

(13) G C A A C G G G C T

Từ kết quả tổng h p trên, th thấy v o tr nh t oạn gen matK th ph n iệt lo i T m thất (Panax notoginseng (Burkill) v lo i T m thất ho ng (Panax stipuleanatus H.T. S i, K.M. Feng) 21 vị tr nu leoti e v ph n iệt v i S m ngọ linh 7 vị tr nu leoti e. Lo i T m thất ho ng (Panax stipuleanatus H.T.

Sai, K.M. Feng) kh iệt v i lo i S m ngọ linh (Panax vietnamensis) 23 vị tr nu leoti e v kh iệt v i thứ S m l i h u v thứ S m l ng i n 22 vị tr nu leoti e. Qu y ũng nh n thấy, T m thất ho ng v T m thất l xẻ kh iệt v i S m vũ iệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 21 vị tr nu leoti e trên oạn gen

90

matK. Nh ng kết quả trên y ho thấy v ng gen matK th hiện ti m n ng l n trong việ ph n iệt t xon ủ hi Panax L.

3.4.3. Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam

Trình t nucleotide của hai loài thuộc chi Aralia c sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup). H i ph ng ph p x y ng cây phát sinh chủng loại c sử dụng là Maximum Likelihook (ML) và Bayesian (BI) ki m tra s t ng qu n v ộ chính xác của hai cách thức thiết l p cây phát sinh chủng loại từ một s d liệu so sánh chung, góp phần nh gi to n iện h n khả n ng ph n iệt loài của các vùng gen nghiên cứu. C y qu n hệ ph t sinh trên s ph i h p tr nh t gen ITS- rDNA và matK gi t xon thuộ hi Panax, y ML v i gi trị ootstr p (BS) và y BI v i gi trị posterior pro ility (PP) nh sau (Hình 3.69, Hình 3.70):

91

Hình 3.74. Cây quan hệ phát sinh d a trên ph i h p vùng gen ITS-rDNA và matK gi a các m u thu th p và các taxon cùng chi Panax L. d trên ph ng ph p M ximum Likelihoo

92

Hình 3.75. Cây quan hệ phát sinh d a trên ph i h p vùng gen ITS-rDNA và matK gi a các m u thu th p và các taxon cùng chi Panax L. d trên ph ng ph p B yesi n

93

Từ y ph t sinh ho thấy hi Panax ph t sinh n ng nh v i gi trị o (BS = 93%, PP = 1.00). Giá trị bootstrap cao cho thấy ộ tin c y cao v kết quả xây d ng cây chủng loại phát sinh.

Kết quả ph n t h m i qu n hệ i truy n trên tr nh t ủ h i gen ITS- rDNA và matK ủ 35 m u nghiên ứu v i 46 m u trên gen nk, chúng tôi có thêm s khẳng ịnh tên kho họ ủ m u x ịnh tên kho họ (Bảng 3.1) là chính xác. Đồng th i kết quả ũng ho thấy m i qu n hệ gần gũi gi các m u T m thất l xẻ (Panax sp.1) v i lo i T m thất ho ng (Panax stipuleanatus H.T.

S i & K.M. Feng) v i gi trị BS = 100% v PP = 1,00. Nh v y T m thất l xẻ (Panax sp.1) ng ph n loại v i lo i T m thất ho ng (Panax stipuleanatus H.T.Ts i et K.M.Feng), h y n i kh , m u T m thất l xẻ tên kho họ l Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng. D trên ph n t h h i tr nh t ITS- rDNA và gen matK.

C ng v i m u ủ T m thất ho ng, m u T m thất l xẻ ph n th nh h i nh nh, trong nh nh 1 gồm m u P.20, P.28, P.33 và P.25 ng ph n tại Sa Pa, Lào Cai. Nh nh 2 gồm m u P.21, P.22, P.23, P.24, P.29, P30 và P.32 ph n tại Ho ng Su Ph , H Gi ng. Trong nh nh 2 l nh nh on nằm trong nhánh 1. Đi u n y th hiện s h iệt i truy n nh gi quần th v i i m ph n kh nh u.

Kết quả ũng hỉ r S m ngọ linh qu n hệ gần gũi v i h i thứ s m v r.

langbianensis và var. fuscidiscus tạo th nh một nh nh n ng nh v i gi trị o (BS = 93%, PP = 0,9984). Cũng trên ph n t h m i qu n hệ trên y hủng loại ph t sinh ủ m u S m pux il ileng (Panax sp.2), nh n thấy m u P.40 và P.41 m i qu n hệ rất gần v i S m l i h u (P. vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai), h i m u S m pux il ileng nằm trong ng nh nh v i S m l i h u (P. vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai) v i gi trị BS ạt 97 v PP ạt 0,9983. Nh v y trên s ph i h p h i v ng gen ITS-rDNA và matK h ng t i x ịnh h i m u P.40 v P.41 thu tại Pu X i L i

94

Leng, thuộ huyện K S n, tỉnh Nghệ An h nh l thứ S m l i h u - P.

vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai. Qu y x ịnh thêm v ng ph n m i ủ thứ S m l i h u.