CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
21 mẫu đã được thu thập trên cả nước, trong đó 19 mẫu thuộc Dây thường xuân (kí hiệu N1-N19) và 2 mẫu Thường xuân (kí hiệu H20, H21) với vị trí thu mẫu được mô tả trong bảng 2.1. Nơi thu mẫu được ghi số hiệu kèm theo lý lịch như địa điểm, tọa độ, thảm thực vật tự nhiên, hiện trạng tác động của con người và một số đặc điểm sinh học. Mẫu thu được chia làm 2 nhóm, một nhóm được bảo quản trong tủ sấy (600C) phục vụ cho việc định danh loài và làm tiêu bản lưu giữ tại phòng tiêu bản và một nhóm mẫu được đem đi để phân tích HPLC.
Bảng 2.1. Danh sách mẫu Dây thường xuân
Stt Kí
hiệu
1 N1
2 N2
3 N3
4 N4
5 N5
6 N6
7 N7
8 N8
10 N10
11 N11
12 N12
13 N13
14 N14
15 N15
16 N16
17 N17
18 N18
19 N19
20 H20*
21 H21*
Với khóa luận này, tham khảo các tài liệu để nắm bắt được các thông tin cơ bản về: I) Vị trí phân loại và danh pháp của loài thuộc chi Hedera. II) Nguồn
14
gốc và vùng phân bố của loài. III) Giá trị sử dụng của các loài. IV) Kế thừa các số liệu và phương pháp nghiên cứu. V) Kế thừa số liệu, kết quả từ các bài báo, các nghiên cứu trong và ngoài nước.
2.2.2. Phương pháp thu thập mẫu vật
Trong quá trình thu thập mẫu vật, chúng tôi thu mẫu làm 2 loại như sau:
I)Mẫu vật phục vụ nghiên cứu hình thái của cây, Thu thập mẫu vật thực hiện làm các tiêu bản khô, mẫu phải có cơ quan sinh sản là hoa hoặc quả hoặc cả hải. các mẫu sau khi thu thập được chúng tôi ép khô để làm mẫu lưu trữ và nghiên cứu về mặt hình thái tại phòng Tiêu bản dược liệu, khoa Tài nguyên dược liệu, Viện dược liệu (NIMM); II) Mẫu phục vụ nghiên cứu giải phẫu của cây: rễ, thân rễ, thân khí sinh, lá (chủ yếu sử dụng các lá bánh tẻ).
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái so sánh
I) Trong quá trình thực hiện khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp phân loại so sánh hình thái theo Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [12]. Để xác định tên khoa học, nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại các taxon của các loài thu thập được. Phương pháp này không đòi hỏi những thiết bị phức tạp, dễ tiến hành, đảm bảo độ chính xác và phù hợp với điều kiện nước ta. II) Đối chiếu các mẫu thu được với mẫu lưu trữ tại phòng Tiêu bản Dược liệu của Viện Dược liệu (NIMM); Bảo tàng sinh học, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (HNU). III) Tham khảo các mô tả về loài và các thứ của loài trong các công trình nghiên cứu khác nhau để xác định tên khoa học cả loài đặc biệt là các chuyên khảo về phân loại như tài liệu của Nguyễn Nghĩa Thìn (2003) [10]. 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu giải phẫu
Chúng tối tiến hành nghiên cứu giải phẫu các phần lá, thân, rễ của các mẫu thu được theo phương pháp nghiên cứu của Nguyễn Bá (1977) [1], Trần Văn Ơn [8, 9]. Phân tích được thực hiện ở phần rễ, thân rễ, thân khí sinh, lá
của các loài thu được. Các bước thực hiện bao gồm:
Cắt mẫu và tẩy nội chất
Bước 1. Cố định mẫu trên dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay microtome và cắt bằng dao lam. Sử dụng phẫu thức cắt ngang. Cắt những lát mỏng qua thân củ, rễ, lá. Thân rễ cắt ngang, rễ cắt ở rễ chính, có thiết diện phù hợp; lá cắt ngang
gân giữa và một phần phiến lá hai bên, đoạn 1/3 kể từ cuống lá, lá được chọn là lá bánh tẻ không quá già hoặc quá non, khảo sát trên nhiều lá để ghi nhận, mô tả đặc điểm chung. Mẫu tươi được cắt trực tiếp không qua xử lý. Tuy nhiên để lưu mẫu vật cho việc kiểm định sau này, mẫu được ngâm trong dung dịch carnoy I trong 24h sau đó chuyển sang dung dịch bảo quản gồm cồn 70o.
Bước 2. Ngâm mẫu ngay sau khi cắt trong dung dịch cloramin 5% hoặc dung dịch natri hypoclorit (nước Javen) trong 20-30 phút. Rửa mẫu qua nước.
Bước 3. Ngâm mẫu trong dung dịch acid acetic 1% trong 10-15 phút để tẩy cloramin còn sót lại. Rửa mẫu qua với nước.
Nhuộm mẫu
Bước 4. Nhuộm mẫu bằng đỏ carmin 0,5% trong 5 phút, khi thấy bám màu đỏ là được.
Bước 5. Nhuộm xanh methylene 1% quan sát đến khi bám màu xanh đậy lamen.
Soi mẫu:
Bước 6. Tiến hành soi mẫu trên kính hiển vi ở thị kính 10x, vật kính 5x, 10x, 20x, 40x và chụp ảnh lại bằng máy ảnh.
2.2.5. Phương pháp định lượng hoạt chất Hederacoside C và Alpha- Hederin trong dược liệu Dây thường xuân
Nghiên cứu định lượng bằng phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký;
hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu; Cột Shim- pack GIST C18 (250 ì 4,6 mm, 5 àm); Nhiợ̀t đụ̣ cụ̣t: 25 oC, thể tớch tiờm: 20 àL; Tụ́c đụ̣
dòng: 1ml/ ph; Bước sóng phát hiện: 210 nm; Pha động; Acetonitrile (Kênh A) và dung dịch acid phosphoric 0,1% (Kênh B); Rửa giải theo chương trình Gradient mô tả trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Chương trình dung môi rửa giải Thời gian (phút)
Chuẩn bị mẫu: Dung dịch thử: cân chính xác 1 g mẫu bột dược liệu thêm khoảng 70 ml cồn 50%, đun hồi lưu trong 2 giờ, sau đó lấy phần dịch trong. Phần bã lại thêm khoảng 70 ml cồn 50% và tiến hành chiết lặp lại. Quá
trình lặp lại 2 lần, gộp phần dịch chiết thu được cô quay chân không tới cắn.
Hòa tan hoàn toàn cắn bằng Methanol và định mức 50 ml, lọc qua màng lọc 0,45 àm thu được dung dịch thử tiờm sắc ký.
Dung dịch chuẩn: cân chất chuẩn Hederacosdie C và Alpha hederin và hòa tan trong Methanol để thu được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác là: 50, 100, 200, 400, 500, 1000 àg/ml.
Thẩm định phương pháp phân tích: Phương pháp phân tích được thẩm định theo yêu cầu chung của ICH bao gồm: tính phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ thu hồi.
Xử lý số liệu: Hàm lượng % chất cần phân tích (X) có trong mẫu lá dây thường xuân được tính theo công thức:
% ( ℎấ / ượ ệ ) =
Trong đó: C nồng độ chất cần phân tích có trong dịch chiết mẫu thử ( àg/ml); M là khụ́i lượng mẫu đem phõn tớch (g); P là đụ̣ tinh khiết của mẫu chuẩn (%); W độ ẩm của mẫu thử (%).
2.2.6. Phân tích kết quả
Sau khi tiến hành các thí nghiệm, kết quả được nhập và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016. Hàm lượng hoạt chất Hederacoside C và Alpha – hederin được phân tích bằng SPSS version 25 với test One – Way ANOVA.
2.3. Vật liệu, thiết bị nghiên cứu 2.3.1. Hóa chất sử dụng
Hóa chất dùng trong nghiên cứu giải phẫu:
- Hóa chất làm tiêu bản: Nước Javen, dung dịch acid acetic 5%, nước cất, glycerin 10%, cồn, thuốc nhuộm: đỏ carmin 0,5%, xanh methylene 1%.
Hóa chất dùng trong nghiên cứu định lượng hoạt chất
- Dung môi hóa chất: methanol và acetonitril (Fisher – Hàn Quốc, HPLC grade), acid formic (Merck – Đức, HPLC grade), H3PO4 80% (Merck - Đức,
HPLC grade), nước cất hai lần đạt tiêu chuẩn HPLC); các dung môi dùng để chiết xuất mẫu đạt tiêu chuẩn phân tích.
- Chất chuẩn Hederacoside C (CAS number 14216-036) độ tinh khiết >
98% và chất chuẩn Alpha-hederin (CAS number 27013-91-8) độ tinh khiết
> 98% do viện công nghệ hóa học cung cấp.
2.3.2. Thiết bị sử dụng
Nghiên cứu đặc điểm thực vật:
-Chụp ảnh mẫu nghiên cứu bằng máy ảnh Canon IXY 30s.
-Kim mũi mác, dao lam, chổi lông, phiến kính, lamen…
-Kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ 745T kết nối camera Nikon DS - Fi2 và máy tính.
-Kính hiển vi Nikon Eclipse Ci kết nối camera Nikon DS – Fi2 và máy tính.
-Tủ sấy WseVen.
-Cân phân tích AND GR – 120 (độ chính xác 0,1 mg) -Máy chiết Shoxlet Velp SER 148.
-Hệ thống HPLC ( Shimadzu) bao gồm: bơm LC-20AD, bộ tiêm mẫu tự động SIL -20AHT, detector SPD – M20A, lò cột CTO – 10AS VP, cụ̣t pha đảo Shim – pack GIST C18 (250 ì4,6 mm, 5 àm).