Trong nghiên cứu này, vật liệu để thực hiện quá trình thử nghiệm gắn kết với phân tử protein là nano Au@chitosan. Vật liệu nano Au@chitosan có cấu trúc lớp chất bảo vệ là các phân tử chitosan tích điện dương trong khoảng pH 4-5 nên có thể tương tác tốt với protein BSA tích điện âm, đồng thời thông qua tác nhân trung gian tạo nối ngang được sử dụng trong nghiên cứu này là tripolyphosphate, liên kết giữa protein và vật liệu nano hình thành sẽ bền chặt hơn. Dựa trên các tính chất đặc biệt của lớp chất bảo vệ chitosan như độ deacetyl hóa, điện tích bề mặt thay đổi tùy theo điều kiện môi trường. Do đó, ảnh hưởng của nồng độ protein, nồng độ của nano Au@chitosan, và pH môi trường đến quá trình gắn kết được khảo sát bằng các phương pháp quang phổ UV-Vis, đo thế zeta, và so sánh với đường chuẩn của phương pháp Bradford.
2.5.1. Quá trình gắn kết protein BSA với hạt nano Au@chitosan
Việc gắn kết protein lên hạt nano Au@chitosan được thực hiện thông qua tác nhân tạo nối ngang là tripolyphosphate (TPP). Trong phương pháp này dung dịch
Dung dịch keo Au@chitosan
1,0 mL Heparin 5000 UI/mL Dung dịch
Au@chitosan-heparin
UV - Vis SEM DLS Zeta
keo nano Au@chitosan được trộn lẫn với TPP (tỷ lệ 5:1, kl/kl) để hình thành các liên kết ngang (cross-linking). Sau đó dung dịch keo có chứa các hạt nano Au@chitosan-TPP được trộn lẫn vào dung dịch chứa BSA có nồng độ được xác định trước đó. Hỗn hợp được khuấy nhẹ trong 60 phút để protein liên kết lên hạt nano và đạt trạng thái cân bằng. Protein có thể được liên kết trên bề mặt hạt nano Au@chitosan thông qua tương tác điện tích và tác nhân tạo nối ngang TPP.
2.5.2. Đánh giá khả năng gắn kết Au@chitosan-TPP-BSA bằng phương pháp quang phổ UV-Vis
Các mẫu được đo bước sóng cực đại hấp thu trước và sau khi thực hiện quá trình gắn kết phân tử protein. Điều kiện nồng độ nano Au@chitosan 0,25 mg/mL, tỷ lệ thêm tripolyphosphate là chitosan-TPP 5:1 (kl/kl) tại pH 4, nồng độ protein BSA thử nghiệm được thay đổi từ 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5 mg/mL. Bước sóng khảo sát thay đổi từ 400-800 nm. Xác định sự dịch chuyển bước sóng và thay đổi cường độ tại vị trí cực đại hấp thu tương ứng cho phép dự đoán về kích thước và số lượng của hạt nano Au@chitosan sau khi gắn kết với protein [88][89].
2.5.3. Đường chuẩn protein theo phương pháp Bradford
Phương pháp dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu của phức hợp protein và thuốc thử Coomassie Brilliant Blue. Với môi trường acid, khi không có sự hiện diện của protein, thuốc thử Coomassie Brilliant Blue có bước sóng hấp thu cực đại khoảng 465 nm, khi tạo phức với protein thì hỗn hợp có cực đại hấp thu ở bước sóng 595 nm. Đo độ hấp thu tại bước sóng 595 nm có thể xác định được nồng độ protein [90]. Xây dựng đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn với các nồng độ đã biết trước, protein được sử dụng trong nghiên cứu này là BSA (Bovine serum albumin (BSA)). Lấy thể tích 1,0 mL dung dịch protein BSA có nồng độ lần lượt là 0; 10; 20; 30; 40; 50 μg/mL pha trong nước cất cho vào ống nghiệm. Cho 5,0 mL thuốc thử Bradford vào các dung dịch trên, lắc đều, để yên 10 phút cho phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng, quan sát thấy màu xuất hiện sau 2 phút và bền trong 1 giờ.
Mẫu đối chứng được thực hiện với 1,0 mL nước cất và 5,0 mL thuốc thử Bradford.
Đo mật độ quang của các hỗn hợp trên ở bước sóng 595 nm, dựng đồ thị biểu diễn
lượng BSA theo độ hấp thu. Sử dụng đường chuẩn để xác định hàm lượng protein trong các nghiên cứu tiếp theo.
2.5.4. Xác định hiệu suất và khả năng gắn kết protein trên hạt nano Au@chitosan
Nano vàng dạng hình sao được tổng hợp sử dụng chất bảo vệ chitosan với điều kiện là: 2,0 mL HAuCl4 nồng độ 2,5 mM; 5,0 mL chitosan 0,06 % (kl/tt), 0,5 mL ascorbic acid 0,5 M tại pH 4, được sử dụng trong thử nghiệm khảo sát khả năng hấp phụ protein. Vật liệu nano vàng@chitosan-TPP với các nồng độ nano Au khác nhau thay đổi từ 0,25; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/mL được cho gắn kết với protein BSA có nồng độ 1 mg/mL tại pH 4, lắc với tốc độ 250 vòng/phút trong 60 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi thực hiện quá trình gắn kết, dung dịch keo chứa hạt nano Au@chitosan-TPP gắn kết với BSA được cho vào ống ly tâm 5,0 mL, hạt nano được tách ra khỏi dung dịch bằng phương pháp ly tâm 20000 vòng/phút trong 30 phút. Phần dịch nổi thu được sau khi ly tâm được gạn cẩn thận và phần protein trong dịch nổi được phân tích với máy đo quang UV-Vis tại bước sóng 595 nm theo phương pháp Bradford. Với mỗi trị số độ hấp thu đo được, dựa vào phương trình tuyến tính và đường chuẩn tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ protein, suy ra nồng độ protein tương ứng có trong phần dịch nổi đã pha loãng.
Tổng hàm lượng protein trong phần dịch nổi được tính theo công thức:
mg protein = a.10-3.n.V (2.1)
Với a: nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (μg/mL).
n: hệ số pha loãng.
V: thể tích phần dịch nổi (mL).
Hiệu suất gắn kết (binding efficiency-BE) và khả năng hấp phụ (Binding capacity- BC) của hạt nano được tính toán theo công thức sau:
Hiệu suất gắn kết - BE (%) = ((Tổng lượng protein – Lượng protein trong dịch nổi)/Tổng lượng protein) x 100 (2.2)
Khả năng gắn kết - BC = ((Tổng lượng protein – Lượng protein trong dịch nổi)/nồng độ hạt nano Au@chitosan-TPP) (2.3)