Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lý, hóa sinh
2.2.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm trong bã sắn [17]
Cân 100g bã sắn, sấy ở 105OC trong máy sấy khô trong một đêm cho đến khối lƣợng không đổi, giảm dần nhiệt độ và tiến hành cân xác định độ ẩm trong bã sắn theo công thức:
Dd(%) = [(W1 - W2) / W1] * 100 Trong đó:
W1: Trọng lƣợng mẫu ban đầu W2: Trọng lƣợng mẫu sấy khô
2.2.1.2. Phương pháp xác định lượng đường khử theo Bertrand[16,17]
* Nguyên tắc:
Trong môi trường kiềm, các đường khử (mantozơ, fructozơ, glucozơ…) có thể dễ dàng khử đồng II oxit thành đồng I oxit, kết tủa đồng I oxít có màu đỏ gạch.
Đồng I oxit khử Fe 3+ thành Fe 2+. Định lƣợng Fe 2+ bằng dung dịch KMnO4 0,1N. Từ lƣợng KMnO4 chuẩn độ tính ra lƣợng Cu 2+ bị khử. Cứ 1ml
KMnO4 0.1N tương đương 6,36mg Cu. Từ lượng Cu đối chiếu với bảng tính được lượng đồng tương ứng.
* Nguyên liệu và hóa chất:
- Nguyên liệu là mẫu thí nghiệm cần định lượng đường khử.
- Hóa chất:
+ HCl 25%
+ NaOH 10%
+ Dung dịch Fehling gồm : Fehling A + Fehling B theo tỉ lệ thể tích 1:1.
Dung dịch Fehling A: 40g CuSO4.5H2O hòa tan trong 1lít nước cất.
Dung dịch Fehling B: hòa tan 200g muối Seignet( NaKC4H4O6) với150g NaOH trong 1lít nước cất.
+ Dung dịch KMnO4 0,1N: cân 1,06g KMnO4 hòa tan trong 1 lít nước cất.
+ Dung dịch Fe2(SO4)3 trong H2SO4: Hòa tan 50g Fe2(SO4)3 vào 108,7ml H2SO4 đặc( d =1,84) khuấy cho tan, sau đó dẫn thể tích tới 1000ml bằng nước cất ta đƣợc hỗn hợp cần pha chế.
* Thí nghiệm:
- Phản ứng Fehling:
+ Cho vào bình tam giác 5ml (Vp) dịch lọc và 20ml dung dịch Fehling, đậy bình bằng đĩa đồng hồ. Đặt bình trên đèn cồn có lót lưới Amian, đun sôi 3 phút kể từ khi xuất hiện bọt khi đầu tiền, xuất hiện kết tủa đỏ gạch. Để bình nguội, dồn kết tủa về một phía, lƣa ý không để kết tủa tiếp xúc với không khí bằng cách luôn để kết tủa ngập trong dung dịch.
- Rửa kết tủa Cu2O:
+ Chắt từ từ dung dịch Fehling qua phễu Bucne. Dùng nước nóng rửa kết tủa nhiều lần cho tới khi dung dịch không có phản ứng với giấy quỳ nữa thì dừng lại.
- Hòa tan kết tủa Cu2O:
+ Đặt phễu Bucne trên bình tam giác có chứa tủa Cu2O, đổ 10ml dung dịch
Fe 3+ sunphat trong axit sunfuaric qua phễu lọc xuống bình tam giác, lắc nhẹ để Cu2O tan hoàn toàn. Dùng nước nón rửa trên phễu cho đến khi nước rửa phễu không còn phản ứng với giấy quỳ, kết thúc hòa tan kết tủa.
- Chuẩn độ:
Chuẩn độ dung dich FeSO4 bằng dung dịch KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30s (Vc)
- Kết quả:
+ Khối lƣợng Cu trong dung dịch phân tích:
g1 = Vc * 6.36 Trong đó:
+ Vc: số ml KMnO4 chuẩn độ.
+ g1: số mg Cu trong dung dịch phân tích.
+ Từ g1 tra bảng xác định được khối lượng đường khử mg trong 5ml dung dịch mẫu phân tích, đổi mg thành g đƣợc (g2).
+ Tỉ lệ phần trăm đường có trong nguyên liệu (X) X(%) = (g2*V*100) : (Vp*g)
Trong đó:
+ V: số ml dung dịch mẫu pha loãng = 100ml + Vp: số ml dung dịch mẫu đem phân tích = 5ml + g: số gam mẫu đem phân tích
2.2.1.3. Phương pháp định lượng tinh bột [16]
* Nguyên tắc:
Phương pháp dựa trên cơ sở:
Tinh bột bị thủy phân thành đường khử dưới tác động của axit HCl và nhiệt độ, qua đó định lượng đường khử sẽ định lượng được tinh bột.
* Thí nghiệm:
- Loại bỏ đường có sẵn thu tinh bột.:
+ Cân 2g nguyên liệu đã nghiền nhỏ, trộn đều, chuyển sang cốc. Cho vào cốc 100ml nước cất, khuấy đều bằng máy khuấy từ trong khoảng 45-60 phút.
Sau đó, lọc tinh bột bằng phễu và giấy lọc. Tráng lại cốc nhiều lần và rủa tinh bột nhiều lần bằng nước để loại bỏ tối đa lượng đường còn bám vào tinh bột.
+ Chuyển phễu lọc chứa tinh bột sang bình tam giác 250ml, dùng đũa thủy tinh nhỏ chọc thủng giấy lọc, dồn tinh bột xuống bình tam giác bằng nước cất( khoảng 80-100ml).
- Chiết rút đường từ nguyên liệu:
+ Cho 125ml HCl 25% vào bình tam giác, đun cách thủy 2,5-3h, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình để thủy phân hoàn toàn lƣợng tinh bột có trong mẫu thành các dạng đường khử. Sau kết thúc, làm nguội bình, trung hòa dịch chiết băng dung dịch NaOH 10%. Chuyển toàn bộ dung dịch trong bình sang bình định mức 250ml, dùng nước cất dẫn đến dung tích bình. Khuấy đều dung dich và lọc qua giấy lọc thu được dung dịch trong suốt để định lượng đường khử.
* Kết quả:
G = 0,9*g2 Trong đó:
+ G: số g tinh bột có trong mẫu phân tích + g2: số g đường khử có trong mẫu phân tích.
+ 0,9: hệ số tính chuyển từ gluco sang tinh bột
2.2.1.4. Phương pháp xác định hàm lượng Cenllulose[18]
* Nguyên tắc:
Phương pháp định lượng xenlulozơ dựa vào tính chất của nó là một hợp chất bền đối với tác dụng của axít mạnh và kiềm mạnh.
* Nguyên liệu, hóa chất:
- Dung dịch HNO3 đặc (d=1,4).
- Dung dịch axit axetic đặc.
- Cồn 96%
- Nguyên liệu là mẫu cần phân tích.
* Thí nghiệm:
Nghiền 2g nguyên liệu cho vào bình tam giác dung tích 100ml, cho thêm 20ml HNO3 đặc và 2ml axit axetic đặc, đun nhẹ trong 30 phút.
Lọc lấy kết tủa, rửa kết tủa bằng nước nóng 2 lần, rửa bằng cồn 900 hai lần, sau đó sấy khô và đem cân, khối lƣợng thu đƣợc là khối lƣợng cellulose trong 2g, từ đó xác định đƣợc hàm lƣợng % cellulose trong mẫu.
* Kết quả:
Hàm lƣợng xelulozơ tính bằng công thức:
X = a*100:W Trong đó:
+ X: hàm lƣợng xenlulozơ tính bằng phần trăm + a: khối lƣợng xenlulozơ (g)
+ W: khối lƣợng mẫu thí nghiệm (g) + Hệ số chuyển thành %
2.2.1.5 Xác định khả năng sinh enzyme (amylase, cellulase, chitinase, protease) bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
Dựa theo phương pháp của Williams, (1983) [14, 59].
* Chuẩn bị cơ chất cho từng loại enzyme: Môi trường gồm 2% thạch có bổ sung 1% tinh bột tan hoặc 1% chitin hoặc 0.5% CMC hoặc 1% gelatin.
Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, đổ vào các đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 25ml sau đó để nguội.
* Chuẩn bị dịch thử enzyme: Bã sắn trồng nấm sò và nấm linh chi sau khi thu hái quả thể đem nghiền với nước bằng máy nghiền đồng thể tỉ lệ 1g cơ chất/5 ml nước, lọc bỏ sợi bằng giấy lọc, li tâm thu dịch trong để thử hoạt tính.
* Thử hoạt tính: Dùng khoan nút chai khoan 2 lỗ trên đĩa thạch. Nhỏ 100àl dịch trong thu đƣợc vào mỗi lỗ. Đặt vào tủ lạnh 40C từ 8 -12h để enzyme khuếch tán vào thạch, sau đó chuyển sang tủ ấm 300C khoảng 24h. Hoạt tính enzyme được hiện hình bằng vòng phân giải khi sử dụng các thuốc thử tương ứng. Hoạt tính Amylase và chitinase đƣợc hiện hình bằng dung dịch liugol (1g KI với 2g I2 trong 300ml nước). Hoạt tính cellulase được hiện hình bằng dung dịch công gô đỏ 1%. Hoạt tính Protease đƣợc hiện hình bằng dung dịch Amonisunfat bão hoà. Hoạt tính các enzyme đƣợc đánh giá sơ bộ bằng độ lớn vòng phân giải (D-d, mm), trong đó D là đường kính vòng phân giải, d là đường kớnh lỗ thạch (ỉ = 8mm).