2.4.1 Khảo sát độ ẩm
Độ ẩm của mẫu được khảo sát theo TCVN 8900 – 2:2012 theo phương pháp sau:
Cách tiến hành: Cân từ 1-2 gam mẫu, chính xác đến 0,1 mg. Cân trước đĩa petri đã được sấy trong 30 phút. Sau đó, chuyển mẫu vào đĩa petri, chú ý dàn đều để bề dày lớp mẫu khoảng 5 mm và không quá 10 mm. Đặt đĩa có chứa mẫu vào tủ sấy, sấy đến khối lượng không đổi ở 105oC. Khi lấy mẫu ra, chuyển vào bình hút ẩm ngay để làm nguội mẫu đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem đi cân mẫu. Độ ẩm của mẫu thử biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo công thức sau:
X = W1-W2
W1 × 100 Trong đó:
26
W1 là khối lượng của phần mẫu thử trước khi sấy, tính bằng gam (g).
W2 là khối lượng của phần mẫu thử sau khi sấy, tính bằng gam (g).
2.4.2 Xác định tính chất vật lý
Tính chất vật lý của tinh dầu phân tích dựa trên TCVN 11424:2016 về tinh dầu cam ngọt. Sau đây là một số tính chất của tinh dầu.
2.4.2.1 Màu sắc và mùi
* Xác định màu sắc và độ truyền suốt
- Xác định màu sắc
Dùng ống hút lấy 20 ml mẫu cho vào ống nghiệm khô, sạch, trong suốt. Dùng mắt quan sát độ trong và màu sắc của tinh dầu.
- Xác định vị
Cân khoảng 1g tinh dầu cho vào đĩa petri khô, sạch. Nhỏ vài giọt nước vào đĩa tinh dầu, trộn đều, dùng lưỡi xác định vị của hỗn hợp đó.
- Xác định mùi
Nhỏ vài giọt tinh dầu lên giấy thấm khô, sạch. Dùng mũi xác định mùi của tinh dầu, cứ 15 phút xác định một lần, khoảng 4-5 lần.
2.4.2.2 Xác định tỉ trọng:
Tỉ trọng của tinh dầu là tỉ số của khối lượng tinh dầu ở 20oC với khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20oC.
- Chuẩn bị bình tỉ trọng
Bình tỉ trọng được rửa sạch bằng hỗn hợp sunfocromic, tráng kỹ bằng nước cất và súc lại bằng axeton, ete hặc etanol, làm khô bằng cách thổi vào bình một luồng không khí khô, nóng hoặc sấy nhẹ ở 70 – 80oC tới khối lượng không đổi. Cân khối lượng của bình và nút chính xác tới 0,0002g. Trong đó, hỗn hợp sunfocromic được điều chế: hòa tan 60g kalibicromat trong 100ml axit sunfuric đậm đặc (H2SO4).
27
- Xác định khối lượng của nước cất
Rót nhẹ nước vào bình cao hơn vạch mức một chút, tránh không tạo bọt khi rót. Ngâm bình vào môi trường điều nhiệt đã duy trì ở 20 ± 0,5oC ngập tới cổ lọ trong 30 phút tới khi nhiệt độ của nước trong bình đạt 20 ± 0,5oC. Dùng các giải giấy thấm hút bớt nước trong bình tới đúng vạch mức và thấm khô các giọt nước bám ở thành trong
cổ bình, lau khô cổ bình và đậy nút. Lấy bình ra khỏi môi trường điều nhiệt, lau khô và cân nhanh chính xác đến 0,0002g và làm khô.
- Xác định khối lượng của tinh dầu
Tiến hành chuẩn bị mẫu tinh dầu tương tự nhưng thay nước cất bằng tinh dầu ta xác định được khối lượng của bình và tinh dầu ở 200 ± 0,50C
- Tỷ trọng của tinh dầu ở 200Cđược xác định theo công thức sau:
20
d 20=
m m
m
m
1 2
2.4.3.3 Chỉ số khúc xạ (được xác định ở 20oC theo phương pháp đo góc giới hạn bằng khúc xạ kế. )
Khúc xạ kế kiểu Abbe hoặc kiểu khác có đèn natri hay các bộ phân bổ chính triệt tiêu hiện tượng tán sắc và cho phép đọc được chỉ số khúc xạ từ 1,3000 đến 1,7000 với
độ chính xác ± 0,0002. Cho dòng nước chảy qua máy để duy trì máy ở 20oC. Tiến hành hiệu chỉnh máy trước khi đo theo hướng dẫn cụ thể của từng loại máy. Mở hộp lăng kính, dùng bông tẩm axeton hoặc exton lau kỹ lăng kính và thấm khô bằng vải mềm hoặc bông thấm nước.
Nhỏ 2 - 3 giọt tinh dầu lên mặt lăng kính mờ phía dưới và áp vào lăng kính bên trên. Khi nhiệt kế của khúc xạ kế chỉ 20oC, nhìn vào thị kính, chỉnh hiện tượng tán sắc nếu có rồi từ từ xoay bộ lăng kính đưa ranh giới giữa hai miền sáng và tối cắt đúng giao điểm của vạch. Đọc chỉ số khúc xạ ở ngang vạch chuẩn. Xác định lại vị trí và đọc chỉ số
ba lần. Chỉ đọc chỉ số khúc xạ khi nhiệt độ đã ổn định. Kết quả là trung bình cộng của
ba giá trị đọc được và làm tròn tới số thập phân thứ tư. Thực hiện lại với các mẫu tinh dầu khác nhau. Chỉ số khúc xạ được xác định bằng công thức sau:
28
NtD = Nt’D + 0,0004 (t’ – t) Trong đó:
NtD - là chỉ số đọc được ở nhiệt độ “t”;
t - nhiệt độ cần tính chuyển.
2.4.1.4 Xác định góc quay cực
Góc quay cực được xác định như sau:
Điều chỉnh máy: Đổ nước cất vào đầy ống của phân cực kế, chú ý tránh có bọt khí ở bên trong và vặn chặt nắp đậy của ống. Đặt ống vào máng của phân cực kế đã bật đèn sáng, xác định sai lệch của điểm o0 so với điểm 0 của du xích.
Đo góc quay cực: Lấy ống trong máy ra, tháo nước đi và lau ống cho thật khô.
Đổ tinh dầu vào đầy ống và tiếp tục đo như khi điều chỉnh máy. Kết quả thu được cần hiệu chỉnh với độ sai lệch của điểm 0o so với điểm 0 của du xích để được giá trị đúng của góc quay cực. Tiến hành đo ít nhất 3 lần với cùng mẫu thử, kết quả là trung bình cộng của ba lần xác định liên tiếp có sai lệch giá trị không vượt quá 0,080. Sai số của phép đo không được vượt quá ± 0,170.
2.4.3 Phân tích thành phần hóa học
Trong phương pháp phân tích thành phần hóa học của hợp chất bay hơi trong tinh dầu người ta sử dụng kỹ thuật GC-MS. Kỹ thuật GC-MS là kỹ thuật sắc kỹ khí và khối phổ dựa vào khối lượng phân tử trên phổ đồ (mũi phân tử) và thời gian lưu (trên sắc kí đồ) để định danh các hợp chất [26, 27].
2.4.3.1 Cấu tạo máy GC-MS
Thiết bị GC-MS gồm: thiết bị sắc kí khí (GC) và thiết bị phân tích phổ khối lượng (MS). Thiết bị GC có cấu tạo: bộ phận cung cấp khí mang, bộ phân tiêm mẫu, lò cột, cột tách và thiết bị sau đưa vào MS. Nhiệm vụ là tách các chất với thời gian lưu khác nhau và lần lượt đưa chúng qua bộ phận ion hóa MS. Cấu tạo chung của MS gồm : nguồn ion, bộ phận tách khối và detector. Nhiệm vụ là tách các thành phần dựa trên sự khác biệt về giá trị m/z.
29
2.4.3.2 Nguyên tắc hoạt động
Thành phần hóa học của các hợp chất bay hơi trong tinh dầu được xác định bằng
kỹ thuật GC – MS. Phân tích mẫu dầu được thực hiện trên máy sắc ký khí (GC) được trang bị cột mao quản FID và cột DB - 5,30m × 0,25mm, độ dày màng 0,25μm, nhiệt
độ được lập trình như sau: 60−240°C tại 4°C/phút. Khí mang là N2 với lưu lượng 2,0ml / phút; cổng phun và nhiệt độ đầu dò lần lượt là 250°C và 300°C. Mẫu được tiêm bằng cách tách và tỷ lệ phân chia là 1:10. Phân tích GC/MS được thực hiện trên hệ thống Hewlett-packard 6890/5972 với cột mao quản DB-5 (30m × 0,25mm; độ dày màng 0,25
μm. Điều kiện hoạt động giống như mô tả ở trên nhưng khí mang là He Phổ khối được lấy ở 70 eV. Phạm vi khối lượng quét là từ 40-400 m/z với tốc độ lấy mẫu là 1.0 lần quét/s. Dữ liệu định lượng thu được từ sự tích hợp điện tử của các vùng cực đại FID. được xác định bởi thời gian lưu của chúng, các chỉ số duy trì, liên quan đến C5 - C28n- ankan, máy tính phù hợp với thư viện WILEY275.L và cũng như bằng cách so sánh phổ khối của chúng với dữ liệu đã có sẵn trong tài liệu. Tỷ lệ thành phần của các hợp chất được xác định được tính toán từ các khu vực đỉnh GC mà không có bất kỳ yếu tố hiệu chỉnh nào và được tính toán tương đối. Việc phân tích tinh dầu là trung bình của ba lần lặp lại[26, 27].
2.4.4 Đánh giá khả năng tạo nhủ
Ổn định nhũ: Nhủ tương được tạo bằng cách hòa tan các polymer theo từng đơn polymer hoặc hỗn hợp polymer theo các tỷ lệ với một phần trăm về khối lượng không đổi. Sau khi chuẩn bị nhũ tương, dung dịch của mỗi mẫu được chuyển sang ống nghiệm, được niêm phong, bảo quản ở nhiệt độ phòng trong một ngày và thể tích của pha trên được đo sau 24 giờ [28-30]. Độ ổn định được đo bằng % phân tách và được biểu thị bằng:
𝑃ℎầ𝑛 𝑡𝑟ă𝑚 𝑡á𝑐ℎ = 𝐻1
𝐻0× 100 Trong đó:
Ho đại diện cho chiều cao ban đầu của nhũ tương (ml)
H1 là chiều cao pha trên (ml).
30
2.4.5 Đánh giá khả năng vi bao
Hiệu quả đóng gói (EE) được xác định theo phương pháp được mô tả bởi Bae và Lee (2008). 15ml hexane được thêm vào 5g khối tinh dầu trong lọ thủy tinh có nắp đậy, được lắc bằng tay để chiết xuất dầu tự do, trong 2 phút ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp dung môi được lọc qua giấy lọc và bột thu được trên bộ lọc được tráng ba lần với 20mL hexane. Sau đó, dung môi được để bay hơi ở nhiệt độ phòng và sau ở 600C, cho đến khi khối lượng không đổi. Dầu không đóng gói (dầu bề mặt) được xác định bằng chênh lệch khối lượng giữa bình sạch ban đầu và bình chứa dầu được chiết xuất. Tổng lượng dầu được giả định là bằng với dầu ban đầu, vì các thử nghiệm sơ bộ cho thấy rằng tất cả dầu ban đầu được giữ lại [28, 30]. Hiệu quả đóng gói (EE) được tính toán từ phương trình:
𝐸𝐸(%) =𝑇0− 𝑆0
𝑇0 × 100 Trong đó :
T0 là tổng hàm lượng dầu
S0 là hàm lượng dầu bề mặt
2.4.6 Hiệu quả sấy
Để đo hiệu quả sấy chúng ta cân 10g sản phẩm tinh dầu cho vào bình cầu 500ml sau đó thêm 250ml vào lắp vào hệ thống chưng cất như phần chưng cất. Sau đó cho thêm một lượng đá bọt phù hợp để tránh dung dịch quá sôi. Sau đó chưng cất 3h thu được hỗn hợp tinh dầu và nước chuyển hỗn hợp vào phễu chiết 250ml. Sau khi tiến hành chiết xong thì cân khối lượng tinh dầu thu được bằng cân kỹ thuật [28, 30]. Hiệu quả sấy được tính theo công thức sau :
𝐻𝑖ệ𝑢 𝑠𝑢ấ𝑡 𝑠ấ𝑦 = 𝐷ầ𝑢 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑣𝑖 𝑏𝑎𝑜
𝐷ầ𝑢 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑛ℎũ 𝑡ươ𝑛𝑔. 100%
2.4.7 Phương pháp kính hiển vi
Để quan sát với kính hiển vi cần chuẩn bị mẫu dạng tiêu bảng ép sau đó quan sát mẫu với kính hiển vi ánh sáng truyền qua (transmited light microcope). Kính hiển vi hoạt theo nguyên tắc: Cho ánh sáng khả kiến từ nguồn sáng qua tụ quang truyền qua
31
mẫu vật đạt trên lam kính. Ảnh của mẫu được tạo thành và phóng đại lần thứ nhất nhớ một thấu kính có tiêu cự ngắn (vài mm) gọi là vật kính. Hình ảnh tiếp tục được phóng đại lên nhiều lần nhờ thấu kính phóng. Hình ảnh phóng đại cuối cùng của mẫu là ảnh thật, quan sát được nhờ thị kính hoặc CDC camera. Độ phân giải của ảnh hiển vi quan học bị hạn chế bởi chiếu xạ. Cần quan sát ở những vị trí khác nhau của mẫu để chứng minh độ đồng đều của mẫu. Khi quan sát hình ảnh không rõ di chuyển vật kính để cho tiêu cự và độ phóng đại phù hợp với một. Hình ảnh cho được cũng rõ ràng và chính xác . Phương pháp này cũng có hạn chế do mẫu bị ép nên kích thước đã bị biến dạng làm kích thước có sự chênh lệch với kích thước thật [31].
32