5.1. Thiết kế ngân hàng cDNA
Ngân hàng cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mDNA của một tế bào. Như vậy, ngân hàng được thiết lập từ một loại tế bào xác định (tế
bào biệt hóa), vì thế, cDNA mang tính tế bào rất cao.
Quá trình chuẩn bị ngân hàng cDNA bao gồm các bước sau đây:
- Chiết tách RNA tổng số, ta phải chọn những tế bào có chứa nhiều mRNA cần thiết và sau đó, làm sạch mRNA.
- Chọn lựa các mRNA chứa nhiều A (polyA) bằng cách tách trên cột xenlulose oligo dT.
- Tổng hợp cDNA sợi kép đầu bằng từ mRNA dưới tác dụng của enzyme sao chép ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman.
- Metyl hóa các vùng hạn chế (có trong đoạn cDNA sợi đôi) được nhận biết bởi enzyme EcoRI để bảo vệ vùng này không bị cắt khi thao tác với EcoRI.
- Tạo đầu dính bằng cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết bởi EcoRI, sau đó, cắt bằng enzyme EcoRI. Trong trường hợp này, chỉ có
đoạn nối bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn (do được metyl hóa). Đưa cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp.
- Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở EcoRI và đã khử
nhóm phosphat.
- Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa và enzyme ligase để tạo vector tái tổ hợp.
hợp để tạo dòng.
- Xác định dòng cần tìm và thành lập ngân hàng cDNA.
Mục đích của việc thiết lập ngân hàng cDNA là nhằm nghiên cứu sự biểu hiện của một gen xác định cùng với những vấn đề liên quan đến sựđiều hòa biểu hiện gen cũng như mối tương tác giữa các gen trong một quá trình sống.
Chú ý: Khi phân tích kết quả thu được ngân hàng cDNA, cần chú ý tác dụng sinh lí từng thời điểm thí nghiệm.
5.2. Sàng lọc ngân hàng cDNA
Một phương pháp phổ biến nhằm sàng lọc ngân hàng cDNA được bắt đầu từ việc tạo canh trường nuôi cấy chứa đựng nhiều khuẩn lạc từ ngân hàng cDNA. DNA plasmid từ mỗi mẻ cấy vi khuẩn gắn với mảnh nhỏ nitro-xenlulose (màng lai) sẽ bị biến tính và lai với mRNA tổng số. Mỗi mRNA khác nhau sẽ được lai trên nitroxelulose với thứ tự cDNA bổ sung của nó. Các mRNA bám vào màng lọc được tách ra và dùng để tổng hợp protein mà nó mã hóa bằng hệ
thống dịch mã invitro. Protein hình thành được đem phân tích xem có phải là sản phẩm của mRNA cần tìm hay không, và từđó, xác định vi sinh vật nuôi cấy chứa gen mong muốn. Sàng lọc tất cả các mẻ nuôi cấy theo cách trên để xác
Chương 5. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
Công nghệ di truyền được ứng dụng rộng rãi vào nhiều lĩnh vực đời sống khác nhau như trong việt bảo vệ sức khoẻ cộng đồng (sản xuất vaccine, sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học để làm thuốc, chữa bệnh bằng liệu pháp gen...) hay ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp (ứng dụng trong chăn nuôi và trồng trọt...), ứng dụng trong công tác bảo tồn, ứng dụng giải quyết vấn đề môi trường...