1. CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP
1.2. Các công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp
1.2.1. Chọn nguyên liệu
DNA được chọn làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường là DNA plasmid và DNA phage. Chúng được thu nhận chủ yếu từ tế bào vi sinh vật,
được tách và làm sạch theo phương pháp chiết tách DNA plasmid, DNA virus (Chương 7).
DNA chứa gen cần nghiên cứu (DNA lạ) cũng được thu nhận từ tế bào sinh vật được chiết tách và làm sạch và kiểm tra theo phương pháp chiết tách DNA. Ngoài ra, người ta còn sử dụng DNA tổng hợp bằng phương pháp hóa học hoặc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược theo cơ chế nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman.
enzyme ligase cùng với sự hợp tác của một số enzyme khác như kinase và alkanline phosphotase,...
1.2.2 Công đoạn cắt với sự tham gia của enzyme RE kiểu II
RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: là những enzyme cắt hạn chế ở
những vị trí xác định và được dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp bởi vì chúng có một số ưu điểm: Hầu như chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác
đảm nhiệm việc cải biên. Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay
ở bên trong hay cạnh trình tự nhận biết. Chúng chỉ cần ion Mg+2 và không cần năng lượng ATP.
Ví dụ:
- Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử DNA và cắt DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dính. Hiệu quả cắt của enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như hàm lượng của enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH và độ tinh khiết của DNA.
1.2.3. Công đoạn nối với sự có mặt của DNA ligase
Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối các đoạn DNA vào vector chuyển gen để tạo plasmid có mang DNA lạ. Phản ứng nối được thực hiện nhờ
enzyme DNA ligase.
DNA ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh nhau (Hình 4.2). Trong sinh học phân tử, người ta coi DNA ligase như một chất keo phân tửđể kết dính các mẫu DNA lại với nhau.
1 - Nối đầu bằng:
Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn DNA đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới tác dụng của enzyme ligase, liên kết phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) được hình thành và hai nucleotide được nối lại với nhau (Hình 4.3a). Khả năng nối hai đoạn DNA đầu bằng rất thấp. Để tăng hiệu suất phản ứng,
thường người ta phải tăng nồng độ của các đoạn DNA. 2 - Nối đầu lệch:
Đầu tiên, hai mảnh DNA đầu lệch do có những base bổ sung nên chúng tiến gần lại nhau để tạo liên kết hydro giữa các base nitơ bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai đầu nối tạo liên kết este giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác dụng của enzyme DNA ligase. Phản ứng nối được thực hiện theo sơ đồ được biểu diễn trên Hình 4.3b.