5. CÁC LOẠI VECTOR CHUYỂN GEN
5.2. Các vector chuyển gen là phage
Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vi khuẩn. Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so với vector là plasmid:
- Dễ xâm nhập vào vi khuẩn.
- Khả năng nhân lên nhanh trong tế bào chủ.
- Khả năng tiếp nhận đoạn DNA lạ lớn hơn plasmid. Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi như: - Thao tác ghép DNA lạ phức tạp.
- DNA tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc như DNA tái tổ hợp là plasmid, mà thành đĩa phân giải xuất hiện trên mặt thạch phủđầy vi khuẩn.
Phần lớn các nhóm phage sử dụng làm vector đều bắt nguồn từ phage λ
thuộc thế hệ thứ nhất.
5.2.1. Phage λ (thế hệđầu)
Cấu tạo (Hình 2.6) gồm hai phần: Phần đầu chứa DNA và được đóng gói trong vỏ protein. Phần đuôi cho phép virus có thể tự cốđịnh trên các tế bào chủ
là vi khuẩn:
- DNA của phage: Sợi đôi, mạch thẳng, dài 48,5kb gồm hàng chục gen.
những đầu dính.
- Cũng như tất cả virus, DNA này được bao bọc trong vỏ protein. Phage sinh sôi nẩy nở theo hai cách:
- Chu kỳ tan: phage được sinh sôi nẩy nở trong vi khuẩn. Các phage mới
được tạo ra sẽđi ra khỏi vi khuẩn bằng cách làm tan vi khuẩn này.
Hình 2.6. Cấu tạo của phage λ
- Sinh tan: Là một kiểu sinh sản khác của virus, phage không làm tiêu tan vi khuẩn, thay vì tự sinh sản trong tế bào chất, phage sát nhập DNA của mình với DNA của vi khuẩn.
5.2.2. Các biến hình của phage λ (phage thế hệ sau)
Các phage thuộc thế hệ thứ hai rất đa dạng, mỗi một loại thích ứng với một mục đích sử dụng.
1 - Giảm một số vùng hạn chế giống nhau:
Phage λ tự nhiên (chưa biến hình) gọi là phage hoang dại có chứa nhiều vùng hạn chế giống nhau như:
- 5 vùng EcoRI
- Nhiều vùng Hind III
Không thể cắt vector này bằng EcoRI hoặc HindIII đề cài vào đây một mảnh DNA lạ. Người ta đã biến hình loại phage λ này chỉ còn chứa một vùng nhận biết của EcoRI tạo ra vector cài và hai vùng EcoRI tạo ra vector thay thế. Ví dụ:
- λ NM607 là vector cài chứa đoạn cài DNA dài 9kb ở vị trí cắt bởi EcoRI trong gen CI.
- λ charon 16: DNA được cài vào vị trí EcoRI làm ức chế gen lacZ. - λ EMBL4 là một vector thay thế, đoạn DNA thay thế dài 23kb.
2 - Làm khuyết những phần không cần thiết: (Hình 2.7)
Phage λ chỉ có thể nhận được DNA lạ trong một chừng mực rất hạn chế. Khả năng của nó sẽ bị giảm rất nhiều khi độ dài genon (bộ gen) lớn hơn 105% (51 ÷ 52kb) hoặc nhỏ hơn 78% (38 ÷ 38,5kb) so với độ dài ban đầu.
Người ta tìm cách tăng chiều dài của đoạn được cài bằng cách giảm đi nhiều hoặc ít chiều dài những phần không cần thiết của genon của phage λ. Trong số các vector bỏ 1/3 phần trung tâm giữa gen J và N. Trong khi đó giữ lại
đầu 5’ (tay trái) vốn mã hoá cho protein đầu, đuôi. Cũng như đầu 3’ (tay phải) vốn mã hoá cho protein thiết yếu cho sự tái bản và chu kỳ tan.
Hình 2.7. Phage λ biến hình
Phần trung tâm giữa gen J và N không cần thiết cho sự sinh sản của phage có thểđược thay bằng DNA lạ. Các đầu mảnh 5’ và 3’ đều là đầu dính.
3 - Cài một mảnh của operon lacZ:
Mục đích là chọn ra phage tái tổ hợp mà đem lại khả năng phân biệt bằng mắt các phage λđã được sát nhập một đoạn cài vào trong bộ gen của chúng.
Bắt đầu từ phage λ người ta đã cấu tạo nên (biến hình) phage λgt11 đó là một vector biểu hiện. Phage này có cài vào gen lacZ một DNA cần tạo dòng. Các phage gtλ11 tạo ra được các vùng tan trắng nếu chúng đã được cài DNA lạ
vào gen lacZ (gen chịu trách nhiệm tổng hợp β-galactosidase).
Các phage gtλ11 tạo ra vùng tan xanh nếu như chúng không tiếp nhận đoạn cài DNA lạ.
Để phát hiện các phage λ tái tổ hợp, người ta cho vào môi trường chứa phage λ tái tổ hợp (môi trường nuôi cấy) một đường X-Gal (5brome-4chloro- indolyl-β-galactopyroside). Giống như đường lactose, nó bị thuỷ phân bởi enzyme β-galactosidase. Người ta có thể dễ dàng phát hiện khi có mặt của enzyme β-galactosidase (Hình 2.8).
5.2.3. Các vector chuyển gen M13
Đặc tính cấu tạo: Là phage thể sợi, xâm nhiễm đặc trưng E. Coli. DNA của phage mạch đơn, có kích thước 6,4kb, trong đó có khoảng 10 gen.
Ứng dụng: Do ưu điểm của loại vector này là tạo được một lượng lớn phần tử DNA chỉ mang trình tự của một mạch, nên chúng thường được dùng xác định trình tự nucleotide trong phương pháp Sanger.
5.2.4. Các biến hình của phage M13
- Vector M13 mp2 là dạng đơn giản nhất, có một hoặc hai trình tự nhận biết bởi EcoRI nhận đoạn cài có đầu dính được cắt bởi enzyme EcoRI.
- Vector M13 mp7 được tạo thành bằng cách đưa thêm vị trí cắt hạn chế
vào gen lacZ của vector M13 mp2. Vector này có 4 điểm nhận biết bởi bốn enzyme cắt hạn chế: EcoRI, BamHI, SalI và PstI.