Khi nghiên cứu về gen, việc xác định được vị trí của gen trên nhiễm sắc thể chưa cho phép kết luận về bản chất của nó như gen đó tương ứng với gen gì, chức năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào. Nhờ việc giải trình tự gen mà người ta đã giải quyết được những khó khăn trên. Có hai phương pháp giải trình gen đó là phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert và phương pháp enzyme của Sanger và cộng sự.
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học. Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.
Trước hết, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32ởđầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng xạ. Xử lý hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đã
đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di. Kết qủa các phản ứng hóa học xử lý mạch DNA được phát hiện bằng điện di trên gel polyacriamid có thể xác định
được trình tự mạch đơn.
Mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ có thể xử lý theo 4 nhóm phản ứng: - Nhóm phản ứng thứ nhất xử lý mạch đơn DNA bằng dimethyl sulphat làm đứt mạch tại G.
- Nhóm phản ứng thứ hai xử lý mạch đơn DNA bằng axit (pH=2) gây đứt mạch đơn tại A hoặc G.
- Nhóm phản ứng thứ ba xử lý mạch đơn DNA bằng hydrazin gây đứt mạch đơn tại T và C.
- Nhóm phản ứng thứ 4 xử lý mạch đơn DNA bằng hydrazin với nồng độ
muối cao làm đứt mạch đơn tại C.
Kết quả: Các phản ứng tạo thành các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên, có kích thước khác nhau. Điện di trên gel polyacriamid (Hình 3.5), đọc kết quả điện di bằng máy phóng xạ tự ghi ta thu được trình tự nucleotide của mạch đơn DNA.
Hình 3.5. Sơđồ giải trình gel theo phương pháp hoá học
có trình tự : 5’−P32ACACTG
Sau khi xử lý bằng phương pháp hóa học và cắt mạch đơn nói trên ta thu
được các phân đoạn sau:
- Kết quả nhóm 1 cắt tại G: P32 ACACT P32ACACTG - Kết quả phản ứng nhóm 2 cắt tại A hoặc G: P32AC P32ACACTG P32 ACACT P32ACACTG - Kết quả phản ứng nhóm 3 cắt tại C hoặc T: P32A P32ACA P32ACACTG P32ACAC P32ACACTG - Kết quả phản ứng nhóm 4 cắt tại C: P32A P32ACA P32ACACTG
Tổng hợp các kết quả, ta thu được trình tự các nucleotide trên mạch đơn DNA, từđó ta biết được trình tự sắp xếp các nucleotide của gen.
4.2. Phương pháp enzyme sử dụng các dideoxynucleotide
Phương pháp này được F. Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977. Nguyên tắc của phương pháp dideoxy là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA-polymerase. Với việc sử
dụng thêm các dideoxynucleotide (ddNTP) với các deoxynucleotide (dNTP) thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi mạch
đơn khoảng 20 nucleotide, bốn loại dNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng
đồng vị phóng xạ) và bổ xung thêm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng. Các ddNTP mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2 khi mạch
đơn DNA đang tổng hợp được gắn 1 ddNTP phản ứng ngừng tổng hợp. Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ, có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP, enzyme Taq DNA-polymerase, dung dịch đệm và có thêm khoảng 1% một loại ddNTP. Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn oligonucleotide
dài ngắn khác nhau một nucleotide và được nhận biết nhờ phương pháp điện di (Hình 3.6). Tổng hợp kêt quả phản ứng ở 4 ống, thu được trình tự các nucleotide của mạch đơn, có thể biết được trình tự sắp xếp các nucleotide trong gen.
Hình 3.6. Sơđồ giải trình gen theo phương pháp Sanger
Ví dụ: Giải trình đoạn gen: 5’- AGTCCAG-3’ - Mạch cần tổng hợp là 3’- TCAGGTC-5’ - Kết quả phản ứng theo loại A: TCAdd TCAGGTC - Kết quả phản ứng loại G: TCAGdd TCAGGdd TCAGGTC - Kết quả phản ứng loại C: TCdd TCAGGTCdd TCAGGTC - Kết quả phản ứng loại T: Tdd TCAGGTdd TCAGGTC
4.3. Phương pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tựđộng
Trong kĩ thuật này, người ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ
mà bằng hóa chất (các fluochrome). Mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Như vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacriamid, kết quả sẽđược xử lý qua một hệ thống vi tính.
Chương 4. CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP VÀ SỰ TÁCH DÒNG
4.