3. Nội dung nghiên cứu
3.1.3.Kết quả tách dòng gen DREB5
Sau khi thu nhận đƣợc gen DREB 5 bằng PCR, sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pTZ57R/T (hình 3.3) và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α và tiến hành nuôi cấy
0,93 kb 1kb
trên môi trƣờng LB agar có bổ sung carbenicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml, IPTG 100mM, để qua đêm.
Hình 3.3. Vector pTZ57R/T
Khi trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng, chúng tôi lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong 3µl LB lỏng có kháng sinh carbenicillin với nồng độ 50µg/ml, tốc độ lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm. Tế bào tái tổ hợp đƣợc thu lại bằng cách ly tâm và tách chiết plasmid tái tổ hợp. Kiểm tra sản phẩm DNA plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0%. Để khẳng định một cách chắc chắn việc gắn đoạn gen mong muốn (đoạn gen DREB 5) vào vector tách dòng pTZ57R/T, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn BamHI và EcolRI để cắt kiểm tra , do vector tách dòng pTZ57R/T có hai vị trí cắt của BamHI và EcolRI ở hai đầ u của vùng cắt gắn đa vị. Vì vậy, nếu vector tái tổ hợp gắn đƣợc đo ạn gen mong muốn thì sau khi cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và EcolRI , plasmid tái tổ
hợp sẽ văng ra một đoạn DNA dài khoảng 930 bp. Kết quả tách dòng gen DREB5 và cắt kiểm tra bằng BamHI và EcolRIđƣợc trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme giới hạnBamHI và
EcolRI
M: marker; Hai dòng 1 và 2 là DNA plasmid mang gen DREB5 có độ dài khoảng 0,93kb
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN DREB5 CỦA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CPB VÀ VNS
Để xác định trình tƣ̣ nucleotide của gen DREB5 đã tách dòng, chúng tôi tiến hành đọc trình tƣ̣ nucleotide của gen DREB 5 trên thiết bị giải trình tự tự động ABI -3130 DNA Capillary Electrophoresis System. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.
Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB với gen DREB5 của giống đậu tƣơng VNS đƣợc trình bày ở hình 3.5.
0,93kb 1kb
2,89kb 3kb
Kết quả cho thấy kích thƣớc của gen DREB5 ở giống đậu tƣơng CPB và giống đậu tƣơng VNS có kích thƣớc 924 nucleotide. Chúng tôi kết luận đã khuếch đại, tách dòng, giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen của hai giống đậu tƣơng CPB và VNS. So sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 ở hai giống đậu tƣơng CPB và VNS cho thấy, hai trình tự này chỉ khác nhau ở 7 vị trí là 211, 331, 417, 424, 889, 890, 891. Do vậy trình tự gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB và VNS có độ tƣơng đồng cao 99,2% (Hình 3.5).
Hình 3.5. So sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 ở giống đậu tƣơng CPB
và giống đậu tƣơng VNS
Việc nghiên cứu về một gen nào đó, ngoài trình tự nucleotide ngƣời ta còn quan tâm đến trình tự amino acid trong phân tử protein là sản phẩm của gen đó. Trên cơ sở này bằng phần mềm BioEdit chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự amio acid suy diễn từ gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng đang nghiên cứu là CPB và VNS, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.7.
Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid của CPB và VNS
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, trình tự amino acid trong protein DREB5 có sự khác nhau giữa giống đậu tƣơng CPB và VNS ở các vị trí 71, 111, 142, 297. Sự tƣơng đồng của hai giống đậu tƣơng về trình tự amino acid đạt 98,7%.
3.3. SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOITIDE CỦA GEN DREB5 GIỮA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CPB VÀ VNS VIỆT NAM VỚI GEN DREB5 CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG KHÁC
từ Trung Quốc, Xanh Tiên Đài Việt Nam và Bản Giốc Việt Nam bằng phần mềm Bioedit đƣợc trình bày ở hình 3.7
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 ở CPB,VNS với Xanh
Tiên Đài, Bản Giốc, EF583447
Thống kê các đặc điểm thay đổi vị trí nucleotide của gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB và VNS với gen DREB5 của giống đậu tƣơng EF583447, Xanh Tiên Đài và Bản Giốc đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thống kê các vị trí nucleotide thay đổi trong gen DREB5 của CPB và VNS với EF583447, Xanh Tiên Đài, và Bản Giốc
EF583447 CPB VNS Xanh Tiên Đài Bản Giốc
28 A T T A A 30 A C C A A 31 A C C A A 37 T T T T C 54 A A A A T 58 T T T T C
111 T C C C T 129 C A A A C 139 A C C C A 141 T A A A T 157 C G G G C 165 A T T T A 174 T A A A T 178 T A A A T 183 G A A A G 198 C - - - C 199 C - - - C 200 A - - - A 201 G - - - G 202 C - - - C 203 A - - - A 204 G - - - G 205 C - - - C 206 A - - - A 220 T T G T T
227 A G G G A 264 A G G G A 270 A G G G A 294 G T T T G 296 T C C C T 308 C G G G C 333 A G G G A 340 A A T A A 357 G C C C G 426 C C A C C 433 G G A G G 453 A C C C A 467 T A A A T 483 T A A A T 486 A G G G A 489 C C C C T 498 A C C C A 508 C T T T C 529 G - - - G
530 A - - - A 531 A - - - A 532 C - - - G 533 A - - - A 534 A - - - A 535 C - - - C 536 A - - - A 537 A - - - A 541 C G G G C 542 A G G G A 547 C G G G C 559 A G G G A 573 A G G G A 589 C A A A C 594 G A A A A 598 T C C C T 601 A C C C A 602 G C C C G 605 - C C C - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
606 - C C C - 607 - C C C - 609 A C C C A 622 C A A A C 624 C G G G C 639 T C C C T 642 G A A A G 648 T C C C T 651 G A A A G 663 G C C C G 672 T C C C T 675 - G G G - 676 - G G G - 677 - T T T - 678 C T T T C 681 G T T T G 683 T C C C T 686 A C C C A 691 A G G G A
696 T A A A T 698 A C C C A 711 A G G G A 724 A C C C A 747 A A A A G 865 G C C C G 867 A G G G A 868 C T T T C 882 - T T T - 883 - G G G - 884 - A A A - 885 - T T T - 887 - C C C - 888 - T T T - 889 - C C C - 890 - A A A - 891 - G G G - 897 A G G G A 907 A G C A A
908 C C G C C
909 T A T A T
922 T C C C T
Theo hình 3.8 và kết quả thống kê ở bảng 3.1 chúng tôi thấy:
(1). Gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB đã không có nucleotide ứng với vị trí từ 198 đến 206 (CCAGCAGCA) và từ vị trí 529 đến 537 (GAACAACAA) so với EF 583447 và có 60 vị trí nucleotide thay đổi do vậy mức độ tƣơng đồng đạt 92,8%. Gen DREB 5 của CPB so với Xanh Tiên Đài có mức độ tƣơng đồng là 99,1% (chỉ thay đổi 4 vị trí nucleotide).Gen DREB5 của CPB so với Bản Giốc, Bản Giốc không có trình tự nucleotide ứng với vị trí từ 32 đến 34 (CAA) so với CPB, gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng này khác nhau về trình tự nucleotide ở 60 vị trí nên mức độ tƣơng đồng là 92,4% và nhƣ so sánh ở trên thì có mức độ tƣơng đồng là 99,2% so với VNS.
(2) Tƣơng tự so sánh gen DREB5 của giống đậu tƣơng VNS với các giống đậu tƣơng khác chúng tôi cũng có kết quả nhƣ sau: Gen DREB5 của VNS và EF583447 có mức độ tƣơng đồng là 92,4%(Gen DREB5 của VNS đã không có trình tự nucleotide ứng với vị trí từ 198 đến 206(CCAGCAGCA) và từ vị trí 529 đến 537 (GAACAACAA) so với EF 583447 và có 64 vị trí nucleotide thay đổi). Gen DREB 5 của VNS so với Xanh Tiên Đài có mức độ tƣơng đồng là 98,5%(với 10 vị trí nucleotide thay đổi). Bản Giốc không có trình tự nucleotide ứng với vị trí từ 32 đến 34 (CAA) so với VNS, gen DREB5 của hai
giống đậu tƣơng này khác nhau về 67 vị trí nucleotide do đó mức độ tƣơng đồng đạt 91,9%.
Bảng 3.2 biểu thị sự so sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gen DREB5 giữa các giống đậu tƣơng khác nhau biểu thị ở hệ số giống nhau và hệ số khác nhau. Kết quả cho thấy năm giống đậu tƣơng có hệ số giống nhau dao động từ 91,9% đến 99,2%; hệ số khác nhau từ 0,8% đến 8,5%.
Bảng 3.2. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gen DREB5
giữa giống đậu tƣơng CPB, VNS với các giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài, Bản Giốc và EF583447 1 2 3 4 5 1 93.3 99.1 93.7 98.5 1 2 7.1 92.4 99.2 91.9 2 3 0.9 8.0 92.8 99.2 3 4 6.6 0.8 7.5 92.4 4 5 1.5 8.5 0.8 8.0 5 1 2 3 4 5
Từ kết quả so sánh trình tự gen DREB5 của năm giống đậu tƣơng sơ đồ hình cây đƣợc thiết lập biểu thị mối quan hệ di truyền của năm giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự gen DREB5 (Hình 3.8).
Hệ số giống nhau
Hệ
số
khác nh
au 1. Xanh Tiên Đài
2. Bản Giốc
3. Cúc lông Phú Bình 4. EF 583447
Nucleotide Substitutions (x 100) 0 3.7 2 CPB.seq VNS.s eq Xanhtiendai.seq BanGioc .s eq EF583447.seq
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền dựa trên trình tự gen
DREB5 của một số giống đậu tƣơng
Hình 3.8 cho thấy 5 trình tự gen đƣợc phân bố ở hai nhóm: Nhóm thứ nhất là các giống đậu tƣơng CPB, VNS và Xanh Tiên Đài; Nhóm thứ hai gồm 2 giống Bản Giốc và giống đậu tƣơng Trung Quốc có mã số trong GenBank là EF583447.
Ngoài trình tự nucleotide chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự amino acid của proein suy diễn từ gen DREB5 của năm giống đậu tƣơng CPB, VNS, EF583447, Xanh Tiên Đài và Bản Giốc bằng phần mềm DNA star thu đƣợc trình bày ở hình 3.9. Theo kết quả ở hình 3.9, giống đậu tƣơng CPB đã có 38 vị trí amino acid khác với giống đậu tƣơng Trung Quốc mã số EF583447. Giống đậu tƣơng CPB có3 vị trí amino acid khác với giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài, và có 36 vị trí khác với giống đậu tƣơng Bản Giốc. Do vậy trình tự amino acid của giống đậu tƣơng CPB và VNS có độ tƣơng đồng cao nhất đạt 98,7%. Hai mẫu CPB và Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng đạt 98,4%, giống đậu tƣơng CPB và EF 583447 có độ tƣơng đồng đạt 89,4%, CPB và Bản Giốc có độ tƣơng đồng đạt 88,7%.
Khi so sánh trình tự amino acid của giống đậu tƣơng VNS với các giống còn lại chúng tôi cũng có kết quả nhƣ sau: giống đậu tƣơng VNS có 39 vị trí amino acid khác với giống EF 583447. VNS so với giống Xanh Tiên Đài chỉ khác ở 5 vị trí amino acid. Giống đậu tƣơng VNS với giống Bản Giốc có
39 điểm. Vậy trình tự amino acid của giống đậu tƣơng VNS và giống Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng cao đạt 97,4%. Trình tự amino acid của giống VNS so với EF583447 có độ tƣơng đồng đạt 88,4%, giữa VNS và Bản Giốc có độ tƣơng đồng đạt 87,7%.
Vị trí các amino acid thay đổi của 5 trình tự gen trên đƣợc trình bày trong bảng 3.3
Hình 3.9. So sánh trình tự amino acid của CPB, VNS với EF583447, Xanh
Bảng 3.3. Trình tự các amino acid của gen DREB5 thay đổi ở các giống đậu tƣơng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Vị trí EF583447 CPB VNS Xanh Tiên Đài Bản Giốc 1 10 Thr (T) Ser (S) Ser (S) Thr (T) Thr (T) 2 11 Thr (T) Pro(P) Pro(P) Thr (T) Thr (T) 3 42 Ser (S) Arg (R) Arg (R) Arg (R) Ser (S) 4 53 Leu (L) Val (V) Val (V) Val (V) Leu (L) 5 55 Gln (Q) His (H) His (H) His (H) Gln (Q) 6 63 His (H) Gln (Q) Gln (Q) Gln Q) His (H) 7 74 Trp (W) Trp (W) Gly (G) Trp (W) Trp (W) 8 76 Asp (D) Gly (G) Gly (G) Gly (G) Asp (D) 9 98 Arg (R) Ser (S) Ser (S) Ser (S) Arg (R) 10 99 Leu (L) Pro(P) Pro(P) Pro(P) Leu (L) 11 103 Pro(P) Arg (R) Arg (R) Arg (R) Pro(P) 12 114 Arg (R) Arg (R) Trp (W) Arg (R) Arg (R) 13 145 Ala (A) Ala (A) Thr (T) Ala (A) Ala (A) 14 156 Leu (L) Gln (Q) Gln (Q) Gln (Q) Leu (L) 15 170 Leu (L) Phe (F) Phe (F) Phe (F) Leu (L)
16 178 Gln (Q) - - - Glu (E)
17 181 Gln (Q) Gly (G) Gly (G) Gly (G) Gln (Q) 18 183 Gln (Q) Glu (E) Glu (E) Glu (E) Gln (Q) 19 197 His (H) Asn (N) Asn (N) Asn (N) His (H) 20 200 Ser (S) Pro(P) Pro(P) Pro(P) Ser (S) 21 201 - Pro(P) Pro(P) Pro(P) -
22 202 Ser (S) Ala (A) Ala (A) Ala (A) Ser (S) 23 203 Glu (E) His (H) His (H) His (H) Glu (E)
24 208 Pro(P) Thr (T) Thr (T) Thr (T) Pro (P) 25 225 Asp (D) Glu (E) Glu (E) Glu (E) Asp (D) 26 226 - Val (V) Val (V) Val (V) -
27 227 Gln (Q) His (H) His (H) His (H) Gln (Q) 28 228 Val (V) Ala (A) Ala (A) Ala (A) Val (V) 29 229 His (H) Pro(P) Pro(P) Pro(P) His (H) 30 231 Thr (T) Ala (A) Ala (A) Ala (A) Thr (T) 31 233 Glu (E) Ala (A) Ala (A) Ala (A) Glu (E) 32 241 Met (M) Leu (L) Leu (L) Leu (L) Met (M) 33 289 Glu (E) Gln (Q) Gln (Q) Gln Q) Glu (E) 34 290 Leu (L) Phe (F) Phe (F) Phe (F) Leu (L) 35 292 - Asp (D) Asp (D) Asp (D) -
36 293 - Ala (A) Ala (A) Ala (A) - 37 294 - Asp (D) Asp (D) Asp (D) -
38 297 Glu (E) Gln (Q) Gln (Q) Gln(Q) Glu (E) 39 303 Thr (T) Ala (A) Arg (R) Thr (T) Thr (T)
Kết quả so sánh mức độ tƣơng đồng trình tự amino acid của protein DREB5 giữa các giống đậu tƣơng đƣợc trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. So sánh mức độ tƣơng đồng amino acid của protein DREB5
giữa các giống đậu tƣơng
1 2 3 4 5 1 90,4 98,4 91,1 97,4 1 2 10,3 88,7 99,0 87,7 2 3 1,6 12,3 89,4 98,7 3 4 9,5 1,0 11,5 88,4 4 5 2,7 13,5 1,3 12,6 5 5 4 3 2 1
Mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid của protein DREB5 giữa các giống đậu tƣơng đƣợc thể hiện trong đồ thị hình 3.10.
Hình 3.10. Sơ đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền dựa trên trình tự amino
acid của protein DREB5 giữa các giống đậu tƣơng
Hệ số giống nhau
Hệ
số
khác nh
au
Nucleotide Subs titutions (x 100) 0 5.7 2 4 CPB.pro VNS.pro Xanhtiendai.pro BanGioc.pro EF583447.pro
1. Xanh Tiên Đài 2. Bản Giốc 3. CPB 4. EF583447 5. VNS
Hình 3.10 cho thấy 5 trình tự amino acid cũng đƣợc phân bố ở hai nhóm: Nhóm thứ nhất là các giống đậu tƣơng CPB, VNS và Xanh Tiên Đài; Nhóm thứ hai gồm Bản Giốc và EF 583447.
Theo Nguyễn Thị Minh Hồng (2010) và Nguyễn Hiệp Hòa (2010) các giống đậu tƣơng CPB, VNS và Xanh Tiên Đài đã đƣợc đánh giá là có khả năng chịu hạn kém.
Giống đậu tƣơng Bản Giốc và giống đậu tƣơng Trung Quốc EF 583447 là những giống chịu hạn tốt.
Điều đó chứng tỏ sự sai khác trong trình tự amino acid của năm giống đậu tƣơng này có liên quan đến khả năng chịu hạn của mỗi giống.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
1. Đã nhân bản, tách dòng thành công và giải trình tự nucleotide của gen mã hoá nhân tố phiên mã DREB5 từ DNA hệ gen của hai giống đậu tƣơng CPB và VNS. Trình tự nucleotide của gen DREB5 của giống CPB và giống VNS dài 924bp .
2. Trình tự nucleotide của gen DREB5 ở giống đậu tƣơng CPB và giống đậu tƣơng VNS có độ tƣơng đồng cao (99,2%). Trình tự nucleotide của gen DREB5 ở giống CPB so với ba giống EF583447, giống Bản Giốc và giống Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng từ 92,4% đến 99,1%. Trình tự nucleotide của gen DREB5 ở giống đậu tƣơng VNS so với ba giống EF583447, giống Bản Giốc và giống Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng từ 92,4% đến 98,5%. 3. Trình tự amino acid của protein DREB5 ở giống đậu tƣơng CPB và giống đậu tƣơng VNS có độ tƣơng đồng cao (98,7%). Trình tự amino acid của protein DREB5 ở giống CPB so với ba giống EF 583447, giống Bản Giốc và giống Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng từ 88,7% đến 98,4%. Trình tự amino acid của protein DREB5 ở giống VNS so với ba giống EF 583447, giống Bản Giốc và giống Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng từ 88,4% đến 97,4%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đề nghị
Cần tiếp tục nghiên c ứu về gen DREB 5 làm cơ sở thiết kế vector mang cấu trúc gen DREB5 phục vụ chuyển gen tạo cây đậu tƣơng biến đổi gen chịu hạn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại Học Quốc gia, Hà Nội: 92 - 98. 2. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị
Đào (1999), Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp.
3. Nguyễn Thị Thúy Hƣờng , Chu Hoàng Mậu , Lê Văn Sơn , Nguyễn Hƣ̃u Cƣờng, Lê Trần Bình , Chu Hoàng Hà (2008), “Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen P 5CS của một số giống đậu tương (Glycine max(L.) Merrill)”, Tạp chí công nghệ sinh học 6(4): 459 – 466.
4. Trần Thị Phƣơng Liên , Nguyễn Huy Hoàng , Đinh Duy Kháng , Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (1998), “Phân lập gen chaperomin ở giống đậu tương chịu nóng M103”, Tạp chí Khoa học công nghệ, 36: 8 - 14.
5. Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng , chịu hạn ở