3. Nội dung nghiên cứu
2.3.4.Tạo vector tái tổ hợp
Sản phẩm PCR đã tinh sạch ở trên đƣợc gắn vào vector pTZ57R/T với thành phần phản ƣ́ng trong bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
1 T4 Ligase Buffer 1
2 T4 Ligase 1
3 pTZ57R/T Vector 1
4 DNA 5
5 Nƣớc cất khƣ̉ ion 2
Tổng 10
Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ ở 220C trong vòng 60 phút và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.
Biến nạp và nuôi cấy tế bào mang vector tái tổ hợp
Biến nạp sản phẩm kết nối trên vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α theo phƣơng pháp sốc nhiệt. Nuôi cấy tế bào và kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong tế bào theo quy trình sau:
- Lấy tế bào khả biến ra khỏi tủ âm, để trong nƣớc đá trong vòng 30 phút - Hút 5µl sản phẩm kết nối cho vào các ống tế bào khả biến (có đảo nhẹ). - Để ống tế bào khả biến trong nƣớc đá 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 420
C trong 90 giây.
- Tiếp tục để trong nƣớc đá trong 2 phút.
- Thêm 150µl LB lỏng vào các ống tế bào khả biến trên (có đảo nhẹ). Và cho ngay các ống tế bào khả biến vào tủ nuôi cấy lắc ở 200vòng/phút, 370
C trong 1 giờ.
- Hút 100µl dịch khuẩn đã nuôi lắc cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung carbenicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml, IPTG 100 mM.
Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen gắn vào plasmid
Sử dụng enzyme cắt giới hạn BamHI để kiểm tra xem gen DREB5 đã có mặt trong plasmid tái tổ hợp. Kết quả sau khi thực hiện phản ứng cắt sẽ thu đƣợc hai phần: tạo một vạch trên hình ảnh điện di có kích thƣớc khoảng 930 bp (đoạn gen đích đƣợc gắn vào vector) và một vạch là phần còn lại của plasmid khoảng 2886 bp.
Bảng 2.6. Thành phần phản ƣ́ng cắt plasmid tái tổ hợp STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1 Buffer tago 2 2 Enzyme EcoRI 1 3 Enzyme BamHI 1 4 DNA plasmid 3 5 Nƣớc cất khử ion 13 Tổng 20 Sản phẩm đƣợc tiến hành ở bể ổn nhiệt 370 C trong vòng 60 phút. Sau đó sản phẩm đƣợc điện di trong gel agarose 1,0% để kiểm tra.