3. Nội dung nghiên cứu
2.3.5.Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide và xử lí số liệu
Xác định trình tự nucleotide đƣợc thƣ̣c hiện trên máy giải trình tƣ̣ động (automated sequencer) ABI Prism 3130 – USA/Japan tại viện Công nghệ sinh học – Hà Nội.
Phân tích, xử lý chuỗi gen và số liệu
Sau khi thu nhận trình tự gen DREB5, tiến hành xƣ̉ lý và so sánh bằng phần mềm BioEdit.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÀ TÁCH DÒNG GEN DREB5 TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CPB VÀ VNS
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số của các giống đậu tƣơng địa phƣơng
Mọi nghiên cứu trên hệ gen đều bắt đầu tƣ̀ việc tách chiết đƣợc DNA hệ gen ở dạng tinh sạch . Đậu tƣơng có hàm lƣợng protein và R NA cao, cho nên nghiên cƣ́u tách chi ết để thu nhận dung dịch DNA tinh sạch sẽ gặp khó khăn hơn so với các đối tƣợng khác.
Lá non 7 ngày tuổi của các giống đậu tƣơng địa phƣơng đƣợc sƣ̉ dụng để tách DNA bộ gen. Lá non giữ ở - 850C cho tới khi sƣ̉ dụng . Lá non đƣợc nghiền thành bột mịn trong cối chày sƣ́ để ở - 850
C. DNA của hệ gen đƣợc chiết ra khỏi tế bào nhờ dung dịch đệm rƣ̉a : Tris HCl 1M; EDTA 0.5M; pH=8; Sorbitol 2M; NaH2PO4 0.4%; H2O và dung dịch đệ m tách : Tris HCl 1M; EDTA 0.5M; pH=8; NaCl 5M; CTAB 4%; H2O. Đặc biệt với đậu tƣơng , tế bào của chúng chƣ́a nhiều protein nên chúng tôi xƣ̉ lý dịch chiết nhận đƣợc bằng chloroform để loại bỏ hoàn toàn protein ra khỏi chế phẩm DNA. Tƣ̀ 200g mẫu nghiên cƣ́u chúng tôi thu đƣợc 200µl dung dịch chiết DNA. Các mẫu DNA có độ tinh sạch đƣợc kiểm tra trên máy quang phổ ở bƣớc sóng λ= 260/280nm và có đỉnh cƣ̣c đại ở bƣớc sóng 260nm. Sau khi xác định nồng độ , chế phẩm DNA đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả cho thấy mẫu DNA thu đƣợc sáng rõ và gọn (Hình 3.1). Điều này chứng tỏ DNA đƣợc tách chiết tƣ̀ các giống đậu tƣơng đều tƣơng đối sạch, không bị đƣ́ t gãy , ít tạp chất và có thể sử dụng để nhân gen bằng kỹ thuật PCR.
Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số 2 giống đậu tƣơng
M: Marker 1kb; 1: CPB; 2: VNS
3.1.2. Nhân gen DREB5 tƣ̀ hai giống đậu tƣơng Cúc lông Phú Bình (CPB) và Vàng Ngân Sơn (VNS)
Trên cơ sở xác định đƣợc nồng độ DNA khuôn tối ƣu cho phản ƣ́ng PCR, chúng tôi tiến hành nhân gen DREB 5 của giống đậu tƣơng CPB và VNS. Sƣ̉ dụng DNA hệ gen làm khuôn để nhân gen DREB 5 với cặp mồ i DREB5soyF/ DREB5soyR đƣợc thiết kế dƣ̣a trên trình tƣ̣ nucleotide của gen DREB5 ở đậu tƣơng đƣợc công bố trên Ngân hàng gen quốc tế . Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 510C. Sau 30 chu kỳ
M 1 2
phản ứng , sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng đ iện di trên gel agarose 1,0% (Hình 3.2)
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen DREB5 của 2 giống đậu tƣơng.
M. Marker 1kb; 1. CPB; 2. VNS
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy cả 2 mẫu đều cho sản phẩm PCR với kích thƣớc khoảng 0,93kb, kích thƣớc này phù hợp với tính toán lý thuyết và tƣơng tự sản phẩm gen DREB5 của giống đậu tƣơng Trung Quốc trong ngân hàng gen Quốc tế là 0,927kb. Chính vì vậy chúng tôi đã sử dụng sản phẩm PCR này để biến nạp và tách dòng.
3.1.3. Kết quả tách dòng gen DREB5
Sau khi thu nhận đƣợc gen DREB 5 bằng PCR, sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pTZ57R/T (hình 3.3) và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α và tiến hành nuôi cấy
0,93 kb 1kb
trên môi trƣờng LB agar có bổ sung carbenicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml, IPTG 100mM, để qua đêm.
Hình 3.3. Vector pTZ57R/T
Khi trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng, chúng tôi lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong 3µl LB lỏng có kháng sinh carbenicillin với nồng độ 50µg/ml, tốc độ lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm. Tế bào tái tổ hợp đƣợc thu lại bằng cách ly tâm và tách chiết plasmid tái tổ hợp. Kiểm tra sản phẩm DNA plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0%. Để khẳng định một cách chắc chắn việc gắn đoạn gen mong muốn (đoạn gen DREB 5) vào vector tách dòng pTZ57R/T, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn BamHI và EcolRI để cắt kiểm tra , do vector tách dòng pTZ57R/T có hai vị trí cắt của BamHI và EcolRI ở hai đầ u của vùng cắt gắn đa vị. Vì vậy, nếu vector tái tổ hợp gắn đƣợc đo ạn gen mong muốn thì sau khi cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và EcolRI , plasmid tái tổ
hợp sẽ văng ra một đoạn DNA dài khoảng 930 bp. Kết quả tách dòng gen DREB5 và cắt kiểm tra bằng BamHI và EcolRIđƣợc trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme giới hạnBamHI và
EcolRI
M: marker; Hai dòng 1 và 2 là DNA plasmid mang gen DREB5 có độ dài khoảng 0,93kb
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN DREB5 CỦA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CPB VÀ VNS (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để xác định trình tƣ̣ nucleotide của gen DREB5 đã tách dòng, chúng tôi tiến hành đọc trình tƣ̣ nucleotide của gen DREB 5 trên thiết bị giải trình tự tự động ABI -3130 DNA Capillary Electrophoresis System. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.
Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB với gen DREB5 của giống đậu tƣơng VNS đƣợc trình bày ở hình 3.5.
0,93kb 1kb
2,89kb 3kb
Kết quả cho thấy kích thƣớc của gen DREB5 ở giống đậu tƣơng CPB và giống đậu tƣơng VNS có kích thƣớc 924 nucleotide. Chúng tôi kết luận đã khuếch đại, tách dòng, giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen của hai giống đậu tƣơng CPB và VNS. So sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 ở hai giống đậu tƣơng CPB và VNS cho thấy, hai trình tự này chỉ khác nhau ở 7 vị trí là 211, 331, 417, 424, 889, 890, 891. Do vậy trình tự gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB và VNS có độ tƣơng đồng cao 99,2% (Hình 3.5).
Hình 3.5. So sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 ở giống đậu tƣơng CPB
và giống đậu tƣơng VNS
Việc nghiên cứu về một gen nào đó, ngoài trình tự nucleotide ngƣời ta còn quan tâm đến trình tự amino acid trong phân tử protein là sản phẩm của gen đó. Trên cơ sở này bằng phần mềm BioEdit chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự amio acid suy diễn từ gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng đang nghiên cứu là CPB và VNS, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.7.
Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid của CPB và VNS
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, trình tự amino acid trong protein DREB5 có sự khác nhau giữa giống đậu tƣơng CPB và VNS ở các vị trí 71, 111, 142, 297. Sự tƣơng đồng của hai giống đậu tƣơng về trình tự amino acid đạt 98,7%.
3.3. SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOITIDE CỦA GEN DREB5 GIỮA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CPB VÀ VNS VIỆT NAM VỚI GEN DREB5 CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG KHÁC
từ Trung Quốc, Xanh Tiên Đài Việt Nam và Bản Giốc Việt Nam bằng phần mềm Bioedit đƣợc trình bày ở hình 3.7
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 ở CPB,VNS với Xanh
Tiên Đài, Bản Giốc, EF583447
Thống kê các đặc điểm thay đổi vị trí nucleotide của gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB và VNS với gen DREB5 của giống đậu tƣơng EF583447, Xanh Tiên Đài và Bản Giốc đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thống kê các vị trí nucleotide thay đổi trong gen DREB5 của CPB và VNS với EF583447, Xanh Tiên Đài, và Bản Giốc
EF583447 CPB VNS Xanh Tiên Đài Bản Giốc
28 A T T A A 30 A C C A A 31 A C C A A 37 T T T T C 54 A A A A T 58 T T T T C
111 T C C C T 129 C A A A C 139 A C C C A 141 T A A A T 157 C G G G C 165 A T T T A 174 T A A A T 178 T A A A T 183 G A A A G 198 C - - - C 199 C - - - C 200 A - - - A 201 G - - - G 202 C - - - C 203 A - - - A 204 G - - - G 205 C - - - C 206 A - - - A 220 T T G T T
227 A G G G A 264 A G G G A 270 A G G G A 294 G T T T G 296 T C C C T 308 C G G G C 333 A G G G A 340 A A T A A 357 G C C C G 426 C C A C C 433 G G A G G 453 A C C C A 467 T A A A T 483 T A A A T 486 A G G G A 489 C C C C T 498 A C C C A 508 C T T T C 529 G - - - G
530 A - - - A 531 A - - - A 532 C - - - G 533 A - - - A 534 A - - - A 535 C - - - C 536 A - - - A 537 A - - - A 541 C G G G C 542 A G G G A 547 C G G G C 559 A G G G A 573 A G G G A 589 C A A A C 594 G A A A A 598 T C C C T 601 A C C C A 602 G C C C G 605 - C C C -
606 - C C C - 607 - C C C - 609 A C C C A 622 C A A A C 624 C G G G C 639 T C C C T 642 G A A A G 648 T C C C T 651 G A A A G 663 G C C C G 672 T C C C T 675 - G G G - 676 - G G G - 677 - T T T - 678 C T T T C 681 G T T T G 683 T C C C T 686 A C C C A 691 A G G G A
696 T A A A T 698 A C C C A 711 A G G G A 724 A C C C A 747 A A A A G 865 G C C C G 867 A G G G A 868 C T T T C 882 - T T T - 883 - G G G - 884 - A A A - 885 - T T T - 887 - C C C - 888 - T T T - 889 - C C C - 890 - A A A - 891 - G G G - 897 A G G G A 907 A G C A A
908 C C G C C
909 T A T A T
922 T C C C T
Theo hình 3.8 và kết quả thống kê ở bảng 3.1 chúng tôi thấy:
(1). Gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB đã không có nucleotide ứng với vị trí từ 198 đến 206 (CCAGCAGCA) và từ vị trí 529 đến 537 (GAACAACAA) so với EF 583447 và có 60 vị trí nucleotide thay đổi do vậy mức độ tƣơng đồng đạt 92,8%. Gen DREB 5 của CPB so với Xanh Tiên Đài có mức độ tƣơng đồng là 99,1% (chỉ thay đổi 4 vị trí nucleotide).Gen DREB5 của CPB so với Bản Giốc, Bản Giốc không có trình tự nucleotide ứng với vị trí từ 32 đến 34 (CAA) so với CPB, gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng này khác nhau về trình tự nucleotide ở 60 vị trí nên mức độ tƣơng đồng là 92,4% và nhƣ so sánh ở trên thì có mức độ tƣơng đồng là 99,2% so với VNS.
(2) Tƣơng tự so sánh gen DREB5 của giống đậu tƣơng VNS với các giống đậu tƣơng khác chúng tôi cũng có kết quả nhƣ sau: Gen DREB5 của VNS và EF583447 có mức độ tƣơng đồng là 92,4%(Gen DREB5 của VNS đã không có trình tự nucleotide ứng với vị trí từ 198 đến 206(CCAGCAGCA) và từ vị trí 529 đến 537 (GAACAACAA) so với EF 583447 và có 64 vị trí nucleotide thay đổi). Gen DREB 5 của VNS so với Xanh Tiên Đài có mức độ tƣơng đồng là 98,5%(với 10 vị trí nucleotide thay đổi). Bản Giốc không có trình tự nucleotide ứng với vị trí từ 32 đến 34 (CAA) so với VNS, gen DREB5 của hai
giống đậu tƣơng này khác nhau về 67 vị trí nucleotide do đó mức độ tƣơng đồng đạt 91,9%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.2 biểu thị sự so sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gen DREB5 giữa các giống đậu tƣơng khác nhau biểu thị ở hệ số giống nhau và hệ số khác nhau. Kết quả cho thấy năm giống đậu tƣơng có hệ số giống nhau dao động từ 91,9% đến 99,2%; hệ số khác nhau từ 0,8% đến 8,5%.
Bảng 3.2. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gen DREB5
giữa giống đậu tƣơng CPB, VNS với các giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài, Bản Giốc và EF583447 1 2 3 4 5 1 93.3 99.1 93.7 98.5 1 2 7.1 92.4 99.2 91.9 2 3 0.9 8.0 92.8 99.2 3 4 6.6 0.8 7.5 92.4 4 5 1.5 8.5 0.8 8.0 5 1 2 3 4 5
Từ kết quả so sánh trình tự gen DREB5 của năm giống đậu tƣơng sơ đồ hình cây đƣợc thiết lập biểu thị mối quan hệ di truyền của năm giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự gen DREB5 (Hình 3.8).
Hệ số giống nhau
Hệ
số
khác nh
au 1. Xanh Tiên Đài
2. Bản Giốc
3. Cúc lông Phú Bình 4. EF 583447
Nucleotide Substitutions (x 100) 0 3.7 2 CPB.seq VNS.s eq Xanhtiendai.seq BanGioc .s eq EF583447.seq
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền dựa trên trình tự gen
DREB5 của một số giống đậu tƣơng
Hình 3.8 cho thấy 5 trình tự gen đƣợc phân bố ở hai nhóm: Nhóm thứ nhất là các giống đậu tƣơng CPB, VNS và Xanh Tiên Đài; Nhóm thứ hai gồm 2 giống Bản Giốc và giống đậu tƣơng Trung Quốc có mã số trong GenBank là EF583447.
Ngoài trình tự nucleotide chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự amino acid của proein suy diễn từ gen DREB5 của năm giống đậu tƣơng CPB, VNS, EF583447, Xanh Tiên Đài và Bản Giốc bằng phần mềm DNA star thu đƣợc trình bày ở hình 3.9. Theo kết quả ở hình 3.9, giống đậu tƣơng CPB đã có 38 vị trí amino acid khác với giống đậu tƣơng Trung Quốc mã số EF583447. Giống đậu tƣơng CPB có3 vị trí amino acid khác với giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài, và có 36 vị trí khác với giống đậu tƣơng Bản Giốc. Do vậy trình tự amino acid của giống đậu tƣơng CPB và VNS có độ tƣơng đồng cao nhất đạt 98,7%. Hai mẫu CPB và Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng đạt 98,4%, giống đậu tƣơng CPB và EF 583447 có độ tƣơng đồng đạt 89,4%, CPB và Bản Giốc có độ tƣơng đồng đạt 88,7%.
Khi so sánh trình tự amino acid của giống đậu tƣơng VNS với các giống còn lại chúng tôi cũng có kết quả nhƣ sau: giống đậu tƣơng VNS có 39 vị trí amino acid khác với giống EF 583447. VNS so với giống Xanh Tiên Đài chỉ khác ở 5 vị trí amino acid. Giống đậu tƣơng VNS với giống Bản Giốc có
39 điểm. Vậy trình tự amino acid của giống đậu tƣơng VNS và giống Xanh Tiên Đài có độ tƣơng đồng cao đạt 97,4%. Trình tự amino acid của giống VNS so với EF583447 có độ tƣơng đồng đạt 88,4%, giữa VNS và Bản Giốc có độ tƣơng đồng đạt 87,7%.
Vị trí các amino acid thay đổi của 5 trình tự gen trên đƣợc trình bày trong bảng 3.3
Hình 3.9. So sánh trình tự amino acid của CPB, VNS với EF583447, Xanh
Bảng 3.3. Trình tự các amino acid của gen DREB5 thay đổi ở các giống đậu tƣơng
STT Vị trí EF583447 CPB VNS Xanh Tiên Đài Bản Giốc 1 10 Thr (T) Ser (S) Ser (S) Thr (T) Thr (T) 2 11 Thr (T) Pro(P) Pro(P) Thr (T) Thr (T) 3 42 Ser (S) Arg (R) Arg (R) Arg (R) Ser (S) 4 53 Leu (L) Val (V) Val (V) Val (V) Leu (L) 5 55 Gln (Q) His (H) His (H) His (H) Gln (Q) 6 63 His (H) Gln (Q) Gln (Q) Gln Q) His (H) 7 74 Trp (W) Trp (W) Gly (G) Trp (W) Trp (W) 8 76 Asp (D) Gly (G) Gly (G) Gly (G) Asp (D) 9 98 Arg (R) Ser (S) Ser (S) Ser (S) Arg (R) 10 99 Leu (L) Pro(P) Pro(P) Pro(P) Leu (L) 11 103 Pro(P) Arg (R) Arg (R) Arg (R) Pro(P) 12 114 Arg (R) Arg (R) Trp (W) Arg (R) Arg (R) 13 145 Ala (A) Ala (A) Thr (T) Ala (A) Ala (A) 14 156 Leu (L) Gln (Q) Gln (Q) Gln (Q) Leu (L) 15 170 Leu (L) Phe (F) Phe (F) Phe (F) Leu (L)
16 178 Gln (Q) - - - Glu (E)
17 181 Gln (Q) Gly (G) Gly (G) Gly (G) Gln (Q) 18 183 Gln (Q) Glu (E) Glu (E) Glu (E) Gln (Q) 19 197 His (H) Asn (N) Asn (N) Asn (N) His (H) 20 200 Ser (S) Pro(P) Pro(P) Pro(P) Ser (S) 21 201 - Pro(P) Pro(P) Pro(P) -
22 202 Ser (S) Ala (A) Ala (A) Ala (A) Ser (S) 23 203 Glu (E) His (H) His (H) His (H) Glu (E)
24 208 Pro(P) Thr (T) Thr (T) Thr (T) Pro (P) 25 225 Asp (D) Glu (E) Glu (E) Glu (E) Asp (D) 26 226 - Val (V) Val (V) Val (V) -
27 227 Gln (Q) His (H) His (H) His (H) Gln (Q) 28 228 Val (V) Ala (A) Ala (A) Ala (A) Val (V) 29 229 His (H) Pro(P) Pro(P) Pro(P) His (H) 30 231 Thr (T) Ala (A) Ala (A) Ala (A) Thr (T) 31 233 Glu (E) Ala (A) Ala (A) Ala (A) Glu (E) 32 241 Met (M) Leu (L) Leu (L) Leu (L) Met (M) 33 289 Glu (E) Gln (Q) Gln (Q) Gln Q) Glu (E) 34 290 Leu (L) Phe (F) Phe (F) Phe (F) Leu (L) 35 292 - Asp (D) Asp (D) Asp (D) -
36 293 - Ala (A) Ala (A) Ala (A) - 37 294 - Asp (D) Asp (D) Asp (D) -
38 297 Glu (E) Gln (Q) Gln (Q) Gln(Q) Glu (E) 39 303 Thr (T) Ala (A) Arg (R) Thr (T) Thr (T)
Kết quả so sánh mức độ tƣơng đồng trình tự amino acid của protein DREB5 giữa các giống đậu tƣơng đƣợc trình bày trong bảng 3.4. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.4. So sánh mức độ tƣơng đồng amino acid của protein DREB5
giữa các giống đậu tƣơng
1 2 3 4 5 1 90,4 98,4 91,1 97,4 1 2 10,3 88,7 99,0 87,7 2 3 1,6 12,3 89,4 98,7 3