PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3. Nội dung nghiên cứu

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số

Để có thể thƣ̣c hiện phản ƣ́ng PCR nhân đoạn gen cần nghiê n cƣ́u , trƣớc hết cần có DNA của hệ gen làm khuôn . Trong một tế bào có 3 hệ gen chƣ́a DNA: hệ gen của nhân , hệ gen của ty thể và hệ gen lạp thể. Nếu tách chiết lấy toàn bộ DNA của cả 3 hệ gen và thu nhận để làm khuôn cho phản ứng PCR thì h ỗn hợp này đƣợc gọi là DNA tổng số. Phƣơng pháp tách DNA tổng số theo Gawel và đtg năm 1991 có cải tiến [16] nhƣ sau:

- Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.

- Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sorbitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.

- Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. - Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.

- Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.

- Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng.

- Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ.

- Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn. - Làm khô DNA bằng máy speed vac.

2.3.2. Định lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số

Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phƣơng pháp:

(1) Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 260nm và 280nm. Nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết đƣợc tính theo công thức:

Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng.

Độ sạch của DNA đƣợc xác định bằng tỷ lệ A260/A280. Dung dịch chứa DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 đƣợc coi là đảm bảo chất lƣợng.

(2) Phƣơng pháp điện di: Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm diện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.

2.3.3. Kỹ thuật PCR

Nhân gen bằng kỹ thuật PCR theo Mullis và đtg năm 1985. Cặp mồi nhân gen DREB5 đƣợc thiết kế dƣ̣a trên cơ sở của trình tự mang mã số EF 583447 trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI).

Bảng 2.3. Mồi nhân gen DREB5

Mồi Trình tự mồi Nhiệt độ gắn mồi

DREBsoy5F 5'-ATGCAATTCCCTCACCAATT-3' 510C DREBsoy5R 5'-TCAATCCTGATCCTTCCACA-3' 510C

Thành phần phản ứng của phản ứng PCR nhân đoạn gen DREB5 ở đậu tƣơng đƣợc trình bày ở bảng 2.4.

Bảng 2.4. Thành phần phản ƣ́ng nhân gen DREB5 STT Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl)

1 PCR Master mix 25

2 Mồi xuôi DREB 5F(10µM) 2

3 Mồi ngƣợc DREB 5R(10µM) 2 4 DNA khuôn (50ng) 4 5 Nƣớc cất khử ion 19 6 Tổng 50 Chu kỳ nhiệt Sản phẩm PCR đƣợc làm sạch bằng bộ kít AccuPrep PCR Purification (Bioneer-Hàn Quốc) theo quy trình của nhà sản xuất.

Quy trình:

- Thêm 100µl Binding buffer vào các ống eppendorf chứa mẫu vừa thực hiện phản ứng PCR, votex nhẹ.

- Hút hết sản phẩm trên sang các ống eppendorf có bổ sung cột lọc. - Ly tâm 13000 vòng/phút/40C. Đổ dịch lỏng, thu cặn bám trên cột lọc.

940C 3’ 940C 1’ 510C 1’ 720C 1’ 30’’ 720C 10’ 40C ∞ 30 Cycles

- Thêm 500µl Washing buffer vào các ống eppendorf. Ly tâm 13000 vòng/phút/40C. Đổ dịch thu cặn bám trên cột lọc.

- Lặp lại bƣớc trên thêm 1 lần nữa

- Ly tâm 13000 vòng/phút/40C thêm một lần nữa cho khô. - Thêm 17µl nƣớc khử ion vào và đợi từ 1-2 phút.

- Ly tâm 13000 vòng/phút/40C ta đƣợc sản phẩm PCR đã tinh sạch.

2.3.4. Tạo vector tái tổ hợp

Sản phẩm PCR đã tinh sạch ở trên đƣợc gắn vào vector pTZ57R/T với thành phần phản ƣ́ng trong bảng 2.5.

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

1 T4 Ligase Buffer 1

2 T4 Ligase 1

3 pTZ57R/T Vector 1

4 DNA 5

5 Nƣớc cất khƣ̉ ion 2

Tổng 10

Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ ở 220C trong vòng 60 phút và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.

Biến nạp và nuôi cấy tế bào mang vector tái tổ hợp

Biến nạp sản phẩm kết nối trên vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α theo phƣơng pháp sốc nhiệt. Nuôi cấy tế bào và kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong tế bào theo quy trình sau:

- Lấy tế bào khả biến ra khỏi tủ âm, để trong nƣớc đá trong vòng 30 phút - Hút 5µl sản phẩm kết nối cho vào các ống tế bào khả biến (có đảo nhẹ). - Để ống tế bào khả biến trong nƣớc đá 30 phút.

- Sốc nhiệt ở 420

C trong 90 giây.

- Tiếp tục để trong nƣớc đá trong 2 phút.

- Thêm 150µl LB lỏng vào các ống tế bào khả biến trên (có đảo nhẹ). Và cho ngay các ống tế bào khả biến vào tủ nuôi cấy lắc ở 200vòng/phút, 370

C trong 1 giờ.

- Hút 100µl dịch khuẩn đã nuôi lắc cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung carbenicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml, IPTG 100 mM.

Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen gắn vào plasmid

Sử dụng enzyme cắt giới hạn BamHI để kiểm tra xem gen DREB5 đã có mặt trong plasmid tái tổ hợp. Kết quả sau khi thực hiện phản ứng cắt sẽ thu đƣợc hai phần: tạo một vạch trên hình ảnh điện di có kích thƣớc khoảng 930 bp (đoạn gen đích đƣợc gắn vào vector) và một vạch là phần còn lại của plasmid khoảng 2886 bp.

Bảng 2.6. Thành phần phản ƣ́ng cắt plasmid tái tổ hợp STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1 Buffer tago 2 2 Enzyme EcoRI 1 3 Enzyme BamHI 1 4 DNA plasmid 3 5 Nƣớc cất khử ion 13 Tổng 20 Sản phẩm đƣợc tiến hành ở bể ổn nhiệt 370 C trong vòng 60 phút. Sau đó sản phẩm đƣợc điện di trong gel agarose 1,0% để kiểm tra.

2.3.5. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide và xử lí số liệu

Xác định trình tự nucleotide đƣợc thƣ̣c hiện trên máy giải trình tƣ̣ động (automated sequencer) ABI Prism 3130 – USA/Japan tại viện Công nghệ sinh học – Hà Nội.

Phân tích, xử lý chuỗi gen và số liệu

Sau khi thu nhận trình tự gen DREB5, tiến hành xƣ̉ lý và so sánh bằng phần mềm BioEdit.

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÀ TÁCH DÒNG GEN DREB5 TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CPB VÀ VNS

3.1.1. Tách chiết DNA tổng số của các giống đậu tƣơng địa phƣơng

Mọi nghiên cứu trên hệ gen đều bắt đầu tƣ̀ việc tách chiết đƣợc DNA hệ gen ở dạng tinh sạch . Đậu tƣơng có hàm lƣợng protein và R NA cao, cho nên nghiên cƣ́u tách chi ết để thu nhận dung dịch DNA tinh sạch sẽ gặp khó khăn hơn so với các đối tƣợng khác.

Lá non 7 ngày tuổi của các giống đậu tƣơng địa phƣơng đƣợc sƣ̉ dụng để tách DNA bộ gen. Lá non giữ ở - 850C cho tới khi sƣ̉ dụng . Lá non đƣợc nghiền thành bột mịn trong cối chày sƣ́ để ở - 850

C. DNA của hệ gen đƣợc chiết ra khỏi tế bào nhờ dung dịch đệm rƣ̉a : Tris HCl 1M; EDTA 0.5M; pH=8; Sorbitol 2M; NaH2PO4 0.4%; H2O và dung dịch đệ m tách : Tris HCl 1M; EDTA 0.5M; pH=8; NaCl 5M; CTAB 4%; H2O. Đặc biệt với đậu tƣơng , tế bào của chúng chƣ́a nhiều protein nên chúng tôi xƣ̉ lý dịch chiết nhận đƣợc bằng chloroform để loại bỏ hoàn toàn protein ra khỏi chế phẩm DNA. Tƣ̀ 200g mẫu nghiên cƣ́u chúng tôi thu đƣợc 200µl dung dịch chiết DNA. Các mẫu DNA có độ tinh sạch đƣợc kiểm tra trên máy quang phổ ở bƣớc sóng λ= 260/280nm và có đỉnh cƣ̣c đại ở bƣớc sóng 260nm. Sau khi xác định nồng độ , chế phẩm DNA đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả cho thấy mẫu DNA thu đƣợc sáng rõ và gọn (Hình 3.1). Điều này chứng tỏ DNA đƣợc tách chiết tƣ̀ các giống đậu tƣơng đều tƣơng đối sạch, không bị đƣ́ t gãy , ít tạp chất và có thể sử dụng để nhân gen bằng kỹ thuật PCR.

Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số 2 giống đậu tƣơng

M: Marker 1kb; 1: CPB; 2: VNS

3.1.2. Nhân gen DREB5 tƣ̀ hai giống đậu tƣơng Cúc lông Phú Bình (CPB) và Vàng Ngân Sơn (VNS)

Trên cơ sở xác định đƣợc nồng độ DNA khuôn tối ƣu cho phản ƣ́ng PCR, chúng tôi tiến hành nhân gen DREB 5 của giống đậu tƣơng CPB và VNS. Sƣ̉ dụng DNA hệ gen làm khuôn để nhân gen DREB 5 với cặp mồ i DREB5soyF/ DREB5soyR đƣợc thiết kế dƣ̣a trên trình tƣ̣ nucleotide của gen DREB5 ở đậu tƣơng đƣợc công bố trên Ngân hàng gen quốc tế . Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 510C. Sau 30 chu kỳ

M 1 2

phản ứng , sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng đ iện di trên gel agarose 1,0% (Hình 3.2)

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen DREB5 của 2 giống đậu tƣơng.

M. Marker 1kb; 1. CPB; 2. VNS

Kết quả ở hình 3.2 cho thấy cả 2 mẫu đều cho sản phẩm PCR với kích thƣớc khoảng 0,93kb, kích thƣớc này phù hợp với tính toán lý thuyết và tƣơng tự sản phẩm gen DREB5 của giống đậu tƣơng Trung Quốc trong ngân hàng gen Quốc tế là 0,927kb. Chính vì vậy chúng tôi đã sử dụng sản phẩm PCR này để biến nạp và tách dòng.

3.1.3. Kết quả tách dòng gen DREB5

Sau khi thu nhận đƣợc gen DREB 5 bằng PCR, sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pTZ57R/T (hình 3.3) và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α và tiến hành nuôi cấy

0,93 kb 1kb

trên môi trƣờng LB agar có bổ sung carbenicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml, IPTG 100mM, để qua đêm.

Hình 3.3. Vector pTZ57R/T

Khi trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng, chúng tôi lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong 3µl LB lỏng có kháng sinh carbenicillin với nồng độ 50µg/ml, tốc độ lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm. Tế bào tái tổ hợp đƣợc thu lại bằng cách ly tâm và tách chiết plasmid tái tổ hợp. Kiểm tra sản phẩm DNA plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0%. Để khẳng định một cách chắc chắn việc gắn đoạn gen mong muốn (đoạn gen DREB 5) vào vector tách dòng pTZ57R/T, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn BamHI và EcolRI để cắt kiểm tra , do vector tách dòng pTZ57R/T có hai vị trí cắt của BamHI và EcolRI ở hai đầ u của vùng cắt gắn đa vị. Vì vậy, nếu vector tái tổ hợp gắn đƣợc đo ạn gen mong muốn thì sau khi cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và EcolRI , plasmid tái tổ

hợp sẽ văng ra một đoạn DNA dài khoảng 930 bp. Kết quả tách dòng gen DREB5 và cắt kiểm tra bằng BamHI và EcolRIđƣợc trình bày ở hình 3.4.

Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme giới hạnBamHI và

EcolRI

M: marker; Hai dòng 1 và 2 là DNA plasmid mang gen DREB5 có độ dài khoảng 0,93kb

3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN DREB5 CỦA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CPB VÀ VNS

Để xác định trình tƣ̣ nucleotide của gen DREB5 đã tách dòng, chúng tôi tiến hành đọc trình tƣ̣ nucleotide của gen DREB 5 trên thiết bị giải trình tự tự động ABI -3130 DNA Capillary Electrophoresis System. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB với gen DREB5 của giống đậu tƣơng VNS đƣợc trình bày ở hình 3.5.

0,93kb 1kb

2,89kb 3kb

Kết quả cho thấy kích thƣớc của gen DREB5 ở giống đậu tƣơng CPB và giống đậu tƣơng VNS có kích thƣớc 924 nucleotide. Chúng tôi kết luận đã khuếch đại, tách dòng, giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen của hai giống đậu tƣơng CPB và VNS. So sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 ở hai giống đậu tƣơng CPB và VNS cho thấy, hai trình tự này chỉ khác nhau ở 7 vị trí là 211, 331, 417, 424, 889, 890, 891. Do vậy trình tự gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB và VNS có độ tƣơng đồng cao 99,2% (Hình 3.5).

Hình 3.5. So sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 ở giống đậu tƣơng CPB

và giống đậu tƣơng VNS

Việc nghiên cứu về một gen nào đó, ngoài trình tự nucleotide ngƣời ta còn quan tâm đến trình tự amino acid trong phân tử protein là sản phẩm của gen đó. Trên cơ sở này bằng phần mềm BioEdit chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự amio acid suy diễn từ gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng đang nghiên cứu là CPB và VNS, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.7.

Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid của CPB và VNS

Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, trình tự amino acid trong protein DREB5 có sự khác nhau giữa giống đậu tƣơng CPB và VNS ở các vị trí 71, 111, 142, 297. Sự tƣơng đồng của hai giống đậu tƣơng về trình tự amino acid đạt 98,7%.

3.3. SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOITIDE CỦA GEN DREB5 GIỮA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CPB VÀ VNS VIỆT NAM VỚI GEN DREB5 CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG KHÁC

từ Trung Quốc, Xanh Tiên Đài Việt Nam và Bản Giốc Việt Nam bằng phần mềm Bioedit đƣợc trình bày ở hình 3.7

Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen DREB5 ở CPB,VNS với Xanh

Tiên Đài, Bản Giốc, EF583447

Thống kê các đặc điểm thay đổi vị trí nucleotide của gen DREB5 của giống đậu tƣơng CPB và VNS với gen DREB5 của giống đậu tƣơng EF583447, Xanh Tiên Đài và Bản Giốc đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Thống kê các vị trí nucleotide thay đổi trong gen DREB5 của CPB và VNS với EF583447, Xanh Tiên Đài, và Bản Giốc

EF583447 CPB VNS Xanh Tiên Đài Bản Giốc

28 A T T A A 30 A C C A A 31 A C C A A 37 T T T T C 54 A A A A T 58 T T T T C

111 T C C C T 129 C A A A C 139 A C C C A 141 T A A A T 157 C G G G C 165 A T T T A 174 T A A A T 178 T A A A T 183 G A A A G 198 C - - - C 199 C - - - C 200 A - - - A 201 G - - - G 202 C - - - C 203 A - - - A 204 G - - - G 205 C - - - C 206 A - - - A 220 T T G T T

227 A G G G A 264 A G G G A 270 A G G G A 294 G T T T G 296 T C C C T 308 C G G G C 333 A G G G A 340 A A T A A 357 G C C C G 426 C C A C C 433 G G A G G 453 A C C C A 467 T A A A T 483 T A A A T 486 A G G G A 489 C C C C T 498 A C C C A 508 C T T T C 529 G - - - G

530 A - - - A 531 A - - - A 532 C - - - G 533 A - - - A 534 A - - - A 535 C - - - C 536 A - - - A 537 A - - - A 541 C G G G C 542 A G G G A 547 C G G G C 559 A G G G A 573 A G G G A 589 C A A A C 594 G A A A A 598 T C C C T 601 A C C C A 602 G C C C G 605 - C C C -

606 - C C C - 607 - C C C - 609 A C C C A 622 C A A A C 624 C G G G C 639 T C C C T 642 G A A A G 648 T C C C T 651 G A A A G 663 G C C C G 672 T C C C T