3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 1. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá triệu chứng bệnh trên đồng ruộng qua từng thời kỳ của cây lúa tại huyện Tiền Hải tỉnh Thái Bình.
- Điều tra, diễn biến sự phát sinh của rầy lưng trắng và bệnh vi rút lùn sọc đen hại lúa tại huyện Tiền Hải - Thái Bình.
- Lây nhiễm nhân tạo bao gồm các thí nghiệm: Xác định tác nhân gây lên hiện tượng lùn sọc đen và phương thức lan truyền, xác định khả năng lan truyền bệnh lùn sọc đen phương Nam trên lúa và cỏ dại, Đánh giá khả năng truyền bệnh của rầy lưng trắng vào các giai đoạn mẫn cảm của cây lúa: 10, 20, 30, 40, 60 ngày tuổi, xác định khả năng truyền virus lùn sọc đen phương Nam lại thế hệ sau của rầy lưng trắng (Sogatella furcifera), đánh giá rầy tuổi nào truyền virus đạt hiệu quả nhất (Rầy lưng trắng, rầy nâu nhỏ, rầy nâu).
- Xác định phản ứng của các giống lúa lai, lúa thuần Trung quốc, Việt nam với bệnh lùn sọc đen
- Đánh giá tính chống chịu của 1 số giống lúa với rầy lưng trắng trong nhà lưới của trung tâm bảo vệ thực vật phía Bắc.
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu
* Phương pháp bảo quản mẫu:
Mẫu thân, lá có biểu hiện triệu chứng bệnh virus được thu thập, làm khô nhanh và bảo quản trong lọ có chứa Silicagen tự chỉ thị.
Phương pháp lấy mẫu: Mỗi triệu chứng lấy 5 mẫu đặc trưng mỗi mẫu lấy 2 khóm cho mỗi giống, mẫu bệnh lấy cả khóm (lá, thân, rễ), rửa rễ bằng nước sạch.
Các mẫu bệnh được đóng gói trong túi nilon và ướp lạnh trong thùng đá, chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích giám định.
- Ghi nhãn mẫu bệnh + Tên người lấy mẫu
+ Ngày lấy mẫu
+ Nơi lấy mẫu (xứ đồng, xã huyện, tỉnh) + Tên giống lúa: giai đoạn sinh trưởng + Mô tả triệu chứng cây bệnh khi lấy mẫu
- Các mẫu bệnh, mẫu rầy được phân tích giám định bằng phương pháp Test Elisa, PCR tại ...
- Khi phát hiện cây lúa có triệu chứng giống bệnh vi-rút lùn sọc đen thì tiến hành lấy mẫu để phân tích giám định
* Điều tra diễn biến của bệnh vi-rút lùn sọc đen trên đồng ruộng.
- Điều tra định kỳ 7 ngày/lần theo Tiêu chuẩn nghành 10 TCN 982: 2006 về Phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại lúa (Ban hành kèm theo Quyết định số 4094/QĐ-BNN-KHCN ngày 29/12/2006 của Bộ trưởng Bộ NN &PTNT).
- Địa điểm điều tra: Huyện Tiền Hải - tỉnh Thái Bình.
- Phương pháp điều tra:
+ Điểm điều tra: Mỗi ruộng điều tra 5 điểm ngẫu nhiên trên 2 đường chéo góc, mỗi điểm điều tra 10 khóm. Điểm điều tra cách bờ ít nhất 2m. Đếm toàn bộ số dảnh hại/số dảnh điều tra.
- Chỉ tiờu theo dừi : Tỷ lệ bệnh (%)
* Điều tra diễn biến mật độ rầy nâu, rầy lưng trắng, rầy nâo nhỏ trên đồng ruộng.
- Chỉ tiờu theo dừi: Điều tra diễn biến về mật độ rầy trờn cỏc trà, giống gieo cấy phổ biến.
- Điều tra định kỳ 7 ngày/lần theo Tiêu chuẩn nghành 10 TCN 982: 2006 về Phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại lúa (Ban hành kèm theo Quyết định số 4094/QĐ-BNN-KHCN ngày 29/12/2006 của Bộ trưởng Bộ NN &PTNT).
- Địa điểm điều tra: Huyện Tiền Hải - tỉnh Thái Bình.
- Phương pháp điều tra:
+ Phương pháp điều tra: Mỗi ruộng điều tra 5 điểm ngẫu nhiên trên 2 đường chéo
góc, mỗi điểm điều tra 10 khóm. Điểm điều tra cách bờ ít nhất 2m. Dùng khay (20 x 20 x 5 cm) dưới đáy khay có lớp dầu mỏng. Đặt nghiêng 1 góc 450 với khóm lúa rồi đập 2 đập, đếm số rầy vào khay rồi nhân với hệ số 2, nhân với số khóm trên 1m2.
+ Khi giai đoạn lúa trỗ: Tại mỗi điểm dùng khay đập 10 khóm dưới gốc và 10 khóm trên bông đập 2 đập, đếm số rầy vào khay rồi nhân với hệ số 2, quy ra mật độ con/m2.
3.4.3. Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptional – Polymerase Chain Reaction)
* Hóa chất cần dùng khi chiết RNA tổng số từ mô lá - Đệm chiết Tripure (Roche)
- Chloroform: isoamyl alcolhol (24:1) - Propanol
- Ethanol 70%
- RNAse free – H2O
* Quy trình chiết tách RNA tổng số bằng Tripure
Bước 1: Nghiền mô bệnh bằng chày cối sứ hoặc trong tube nhựa + chày nhựa ( tùy từng loại mô, mẫu cần tách chiết ) với 500 μl đệm Tripure, sau đó chuyển vào tube 1,5 ml. Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng
Bước 2: Thêm vào tube 100 μl Chlorofom, lắc mạnh, sau đó ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 15 phút.
Bước 3: Lấy pha lỏng phía trên (? μl) chứa RNA cho vào một tube mới Bước 4: Kết tủa lượng RNA bằng một thể tích propanol tương ứng. Sau đó ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 5: Ly tâm 10 phút. Loại bỏ dịch trong phía bên trên giữ lại phần cặn phía dưới. Rửa cặn 2 lần với Ethanol 70%.
Bước 6: Hòa trong 20 μl RNAse free – H2O
* Thành phần của phản ứng RT – PCR
Phản ứng được thực hiện trong tube Effpendorf 0.5 ml dùng chứa các thành
phần sau:
Tên Tỷ lệ (μl)
H2O 15.6
Bf Dream 2.0
d NTPs 0.3
RB- S10- F2 0.3
RB- S10- R2 0.3
Rv acid 0.2
Dream Taq 0.3
RNA 1
Tổng thể tích 20
* Chu trình PCR
Phản ứng RT – PCR được thực hiện theo các điều kiện sau:
- Tổng hợp sợi cDNA trong 30 giây ở 45 OC - Khởi đầu biến tính 4 phút ở 94 OC
- Tiến hành 35 chu kỳ phản ứng ở 94 OC trong 35 giây; 54 OC trong 35 giây;
72 OC trong 1 phút
- Cuối cùng là bước kết thúc ở 72 OC trong 5 phút.
* Chạy điện di sản phẩm PCR
- Chuẩn bị gel: Cân 0,5g Agarose hòa tan trong đệm TAE 1%, đem đun nóng để agarose tan hoàn toàn, sau đó bổ sung thêm 1μl dung dịch Ethidium bromide.
- Chuẩn bị khay đựng gel và chọn lược với lượng giếng thích hợp số mẫu cần chạy điện di. Tiếp theo đổ gel khi nhiệt độ khoảng 50 OC (chú ý: khi đổ nếu thấy gel đã đông phải lập tức đun nóng lại).
- Khi gel đông đem đặt vào bể điện di, đổ đầy bể điện di bằng đệm TAE 1%, đảm bảo đệm ngập qua mặt gel.
- Cài mẫu: Lấy 10 μl sản phẩm PCR + 2μl Loading Dye cho vào các giếng của bản gel.
- Cắm nguồn điện, chú ý sao cho các mẫu sẽ chạy từ cực (-) sang cực (+).
Thông thường ta chạy điện di với hiệu điện thế 100V trong khoảng 30 phút.
- Xem kết quả PCR dưới ánh sáng cực tím.