3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
3.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định tác nhân gây lên hiện tượng lùn sọc đen và phương thức lan truyền.
* Thí nghiệm được tiến hành với 3 nguồn rầy (rầy lưng trắng, rầy nâu, rầy nâu nhỏ), 1 nguồn bệnh bị nhiễm vi rút lùn sọc đen, giống để làm thí nghiệm (bắc thơm số 7).
+ Nguồn rầy (rầy lưng trắng, rầy nâu, rầy nâu nhỏ) mang bệnh ngoài tự nhiên: rầy bắt trực tiếp trên ruộng lúa bị bệnh tại Tiền Hải tỉnh Thái Bình.
+ Nguồn rầy (lưng trắng, rầy nâu, rầy nâu nhỏ) bị nhiễm bệnh nhân tạo: cho rầy sạch tuổi 3 tiếp xúc với cây lúa bị bệnh trong thời gian 10 ngày, sau đó chúng được dùng trong các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo (nguồn rầy sạch là nguồn rầy được nuôi trong phòng thí nghiệm qua 2 thế hệ).
+ Nguồn bệnh: Các mẫu bệnh được thu tại Huyện Tiền Hải tỉnh Thái Bình được trồng tại nhà lưới của trung tâm phía Bắc (giống bắc thơm số 7).
- Phương pháp lây nhiễm:
+ Lây nhiễm tập thể: Thả rầy đã nhiễm bệnh vào ô thí nghiệm chụp lồng lưới côn trùng, đảm bảo tỷ lệ 1 rầy/1 lúa, thời gian tiếp xúc là 48 giờ, sau đó tiến hành diệt rầy bằng thuốc hoá học.
+ Lây bệnh cá thể: Cho 1 rầy đã nhiễm bệnh tiếp xúc với 1 cây lúa trồng trong ô thí nghiệm 10 ngày tuổi trên giống bắc thơm số 7 được chụp lồng lưới cách ly côn trùng, mỗi cây lúa được chụp 1 lồng mica thủng 1 đầu , thời gian tiếp xúc là 48 giờ, sau đó tiến hành diệt rầy bằng thuốc hoá học.
3.5.2. Thí nghiệm 2: Xác định khả năng lan truyền bệnh lùn sọc đen phương Nam trên lúa và cỏ dại (lồng vực, đuôi phụng).
Thí nghiệm được tiến hành với 2 công thức.
Công thức 1: Rầy khoẻ chích nạp trên cây lúa bị nhiễm bệnh sau đó cho chích truyền trên lúa và cỏ dại khoẻ.
Công thức 2: Công thức đối chứng, rầy khoẻ chích nạp trên cây lúa và cỏ dại khoẻ - Phương pháp lây nhiễm: Các loài rầy sạch vi rút tuổi 3 được thả vào chậu cây lúa nhiễm bệnh, cho chúng chích hút 10 ngày, sau đó chuyển sang cây lúa khẻo
10 ngày tuổi và cỏ dại để lây bệnh với số lượng 10 cá thể/chậu vại/cây, cho chúng truyền vi rút trong 2 ngày rồi đưa ra khỏi chậu vại và tiến hành diệt trừ bằng thuốc hóa học. Mỗi cây sau khi lây nhiễm được cách ly bằng lồng lưới chống côn trùng đến khi biểu hiện triệu chứng bệnh (Công thức đối chứng thả rầy sạch).
3.5.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng truyền bệnh của rầy lưng trắng vào các giai đoạn mẫn cảm của cây lúa: 10, 20, 30, 40, 60 ngày tuổi.
- Tiến hành thí nghiệm xác định giai đoạn mẫn cảm của cây lúa đối vi rút lùn sọc đen phương Nam ở các giai đoạn: 10, 20, 30, 40, 60 ngày tuổi. Mỗi giai đoạn sinh trưởng của cây là một thí nghiệm, mỗi thí nghiệm gồm 2 công thức, trong đó 1 công thức lây bệnh và một công thức đối chứng. Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần mỗi lần nhắc lại 30 cây
- Phương pháp lây nhiễm: Rầy lưng trắng sạch vi rút tuổi 3 được thả vào chậu cây lúa nhiễm bệnh, cho chúng chích hút 10 ngày, sau đó chuyển sang cây lúa khỏe 10, 20, 30, 40, 60 ngày tuổi, với số lượng 1 cá thể/vại/cây, cho chúng truyền vi rút trong 2 ngày rồi đưa ra khỏi vại và tiến hành diệt trừ bằng thuốc hoá học. Mỗi cây sau khi lây nhiễm được cách ly bằng lồng lưới chống côn trùng đến khi biểu hiện triệu chứng bệnh (công thức đối chứng thả rầy sạch).
3.5.4. Thí nghiệm 4: Thí nghiệm xác định mật độ hiệu quả nhất của rầy lưng trắng (Sogatella furcifera) mang nguồn bênh virus lùn sọc đen phương Nam
- Tiến hành thí nghiệm xác định mật độ rầy lưng trắng (Sogatella furcifera) truyền bệnh lùn sọc đen phương Nam hiệu quả nhất tại các mật độ là: 1, 3, 5, 7 cá thể/
cây.
- Phương pháp lây nhiễm: Rầy lưng trắng sạch vi rút tuổi 3 được thả vào chậu cây lúa nhiễm bệnh, cho chúng chích hút 10 ngày, sau đó chuyển sang cây lúa khỏe 10 ngày tuổi để lây bệnh với số lượng 1, 3, 5, 7 cá thể/chậu vại/cây, cho chúng truyền vi rút trong 2 ngày rồi đưa ra khỏi chậu vại và tiến hành diệt trừ bằng thuốc diệt rầy. Mỗi cây sau khi lây nhiễm được cách ly bằng lồng lưới chống côn trùng đến khi biểu hiện triệu chứng bệnh (công thức đối chứng thả rầy sạch).
3.5.5. Thí nghiệm 5: Xác định khả năng truyền virus lùn sọc đen phương Nam lại thế hệ sau của rầy lưng trắng (Sogatella furcifera)
- Tiến hành thí nghiệm xác định khả năng truyền vi rút lùn sọc đen phương Nam lại thế hệ sau của rầy lưng trắng (Sogatella furcifera) nhằm đưa ra những dự báo và biện pháp phòng ngừa bệnh hiệu quả.
- Phương pháp tiến hành: Rầy lưng trắng sạch bệnh tuổi 3 được thả vào ống nghiệm chứa 1 cây lúa nhiễm bệnh, cho chúng chích hút trong 10 ngày. Sau đó tiến hành nuôi sinh học cho chúng đẻ trứng.
+ Tiến hành kiểm tra sự tồn tại của vi rút lùn sọc đen phương Nam trong trứng của rầy lưng trắng nhiễm bệnh bằng phương pháp RT-PCR.
+ Tiếp tục nuôi sinh học trứng của rầy lưng trắng để chúng nở thành rầy trưởng thành. Lây nhiễm nhân tạo chúng trên cây lúa sạch bệnh nhằm đánh giá khả năng truyền virus SRBDSV của thế hệ sau rầy nhiễm bệnh.
* Lây nhiễm cá thể: Rầy lưng trắng thế hệ sau được thả vào ống nhiệm chứa 1 cây lúa khỏe 10 ngày tuổi để lây bệnh với số lượng 1 cá thể/ống nghiệm/cây, cho chúng truyền virus đến khi chúng chết. Cây lúa sau khi lây nhiễm được cách ly bằng lồng lưới chống côn trùng đến khi biểu hiện triệu chứng bệnh (tiến hành thí nghiệm trên 30 cây)
* Lây nhiễm tập thể: Rầy lưng trắng thế hệ sau được thả vào ống nghiệm chứa 1 cây lúa khỏe 10 ngày tuổi để lây bệnh với số lượng 10 cá thể/chậu vại/cây, cho chúng truyền vi rút đến khi chúng chết. Cây lúa sau khi lây nhiễm được cách ly bằng lồng lưới chống côn trùng đến khi biểu hiện triệu chứng bệnh (tiến hành thí nghiệm trên 30 cây).
3.5.6. Thí nghiệm 6: Đánh giá rầy tuổi nào truyền vi rút đạt hiệu quả nhất
- Tiến hành thí nghiệm đánh giá rầy lưng trắng (Sogatella furcifera) tuổi nào truyền vi rút đạt hiệu quả nhất tại các tuổi rầy như: rầy trưởng thành, rầy tuổi 3 và tuổi 4.
- Phương pháp lây nhiễm: Thả rầy lưng trắng sạch vi rút tuổi 3, tuổi 4, trưởng thành vào chậu trồng cây bệnh cho chúng chích hút trong 2 ngày. Sau đó chuyển sang cây lúa khỏe 2 ngày. Thả 30 rầy/cây lúa TN được đặt trong ống
nghiệm (30 cây). Cho rầy chích truyền 2 ngày rồi phun thuốc diệt rầy. Mỗi cây sau khi lây nhiễm được cách ly bằng lồng lưới chống côn trùng đến khi biểu hiện triệu chứng bệnh.
3.5.7. Thí nghiệm 7: Đánh giá phản ứng các giống lúa thuần, lai của Trung Quốc và lúa cổ truyền Việt Nam gồm 5 giống.
- Lúa lai Trung Quốc: Thanh ưu
- Lúa thuần Trung Quốc: Bắc thơm, Khang dân - Lúa cổ truyền: Tám cao cây, nếp TK90.
Mỗi giống cấy 1m2 : 100 cây Thả rầy quần thể: 100 rầy/ 100 lúa
Rầy lưng trắng sạch 2 ngày tuổi thả trên cây bệnh chích hút 24h sau thu lại rầy đem thả trên các giống lúa khoẻ 10 ngày tuổi , sau 24h đuổi rầy và đem cấy vào các ô xi măng có lồng lưới cách ly côn trùng.
Mỗi giống có 1 chậu đối chứng cho RLT khoẻ chích hút sau 24h đuổi rầy ra.
Các giống lúa được gieo vào khay nhựa 100 lỗ để trong lồng cách ly được 10 ngày tuổi đem ra làm thí nghiệm.
Tất cả các bước tiến hành trên thực hiện trong nhà lưới và lồng cách ly côn trùng.
3.5.8. Thí nghiệm 8: Đánh giá tính chống chịu của 1 số giống lúa với rầy lưng trắng
Phương pháp bố trí thí nghiệm: theo phương pháp của IRRI
Mạ gieo ô bàn cờ 50 ô, sử dụng check kháng: IR53386, check nhiễm: TN1 Mạ được 5 lá thả rầy lưng trắng tuổi 2 vào với mật độ 5-6 con/ 1 dảnh mạ.
TN1 bắt đầu cháy thì tiến hành đánh giá theo thang điểm của IRRI:
Cấp 0: không bị hại Cấp 1: bị hại rất nhẹ
Cấp 3: đỉnh lá thứ nhất và thứ 2 bị vàng cam, lùn nhẹ Cấp 5: hơn 1 nửa số lỏ bị vàng cam ở đỉnh lỏ, cõy lựn rừ rệt Cấp 7: hơn nửa số cây bị chết, số cây còn lại bị lùn và héo Cấp 9: tất cả các cây bị chết.