CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng với hóa chất của muỗi Aedes 2.4.1.1 Phương pháp thu mẫu
Thực hiện theo hướng dẫn của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng và côn trùng Trung ƣơng [41]:
- Điều tra tất cả các dụng cụ chứa nước trong và ngoài nhà của các hộ gia đình để xác định dụng cụ chứa nước có bọ gậy Aedes. Thu thập bọ gậy bằng vợt hoặc pipet. Bọ gậy của mỗi điểm nghiên cứu đƣợc để riêng trong từng lọ để vận chuyển. Trên đó có ghi nhãn gồm: thông tin về địa điểm và thời gian thu thập mẫu trước khi vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành nhân nuôi.
2.4.1.2. Nhân nuôi bọ gậy trong phòng thí nghiệm
Thực hiện theo hướng dẫn của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng và côn trùng Trung ƣơng [41]:
- Chuyển bọ gậy vào các khay để sẵn trong buồng nuôi. Dán nhãn có thông tin về địa điểm, ngày tháng và thế hệ thu thập (F0) lên từng lồng.
- Cho bọ gậy ăn thức ăn do Viện Sốt rét – Ký sinh trùng và côn trùng Trung ƣơng sản xuất.
- Bọ gậy nuôi trong phòng nuôi côn trùng với điều kiện nhiệt độ 250C -280C, độ ẩm 80% ± 10, thời gian chiếu sáng 8/24 giờ.
- Hàng ngày nhặt quăng cho vào lồng nuôi riêng, khi quăng lột xác thành muỗi thì tiến hành định loại để xác định muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus.
- Cho muỗi đã định loại vào lồng riêng, cho hút dung dịch glucoza 10%.
Muỗi 2-3 ngày tuổi cho hút máu chuột nhắt trắng, sau khi hút máu 2-3 ngày cho muỗi đẻ.
- Lút bờn trong cốc thủy tinh 1 lớp giấy thấm cú ghi rừ thời gian để thu trứng, đổ nước ngập nửa giấy. Trứng được thu hàng ngày sau đó để khô rồi bảo quản trong lọ thủy tinh có nắp đậy kín.
- Sau khi thu đủ số trứng thì thực hiện cho trứng nở để thu thể hệ F1.
Khi trứng nở, chăm sóc bọ gậy cho đến khi thành quăng và muỗi trưởng thành.
Muỗi nở hàng ngày đƣợc đƣa vào cỏc lồng riờng biệt cú dón nhón ghi rừ ngày thỏng muỗi nở để thực hiện thử nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng.
- Muỗi cái 2-5 ngày tuổi dùng để thử độ nhạy cảm theo phương pháp giấy tẩm hoá chất của WHO.
2.4.1.3 Phương pháp thử nghiệm sinh học
Thực hiện theo hướng dẫn của WHO/CDS/CPC/MAL/98.12 [53].
a. Giấy thử
Giấy thử nghiệm đƣợc tẩm hóa chất, giấy đối chứng đƣợc tẩm dung môi pha hóa chất đó do WHO cung cấp:
Bảng 2 1. Các loại hoá chất và nồng độ thử nghiệm
TT Nhóm hóa chất Tên hóa chất Nồng độ (%)
1 Phốt pho hữu cơ Malathion 5
2 Pyrethroid Permethrin 0,75
Deltamethrin 0,05
b. Dụng cụ thử nghiệm (do WHO cung cấp)
- 14 ống nhựa có chiều dài 12,5 cm, đường kính 4,4 cm. Trong đó 5 ống có chấm đỏ dùng để cho muỗi tiếp xúc với hóa chất, 9 ống có chấm xanh dùng cho muỗi nghỉ và đối chứng; Nắp của đầu ống đƣợc bịt chặt bằng vải màn để muỗi không thoát ra ngoài.
- 7 nắp kéo có khoan lỗ để chuyển muỗi từ ống nhựa này sang ống nhựa khác.
- 7 tờ giấy sạch để dùng cho ống nghỉ, 2 tờ giấy đối chứng và 5 tờ giấy tẩm hóa chất cần thử với nồng độ khuyến cáo của WHO (giấy tẩm do hóa chất và giấy chứng WHO cung cấp).
- 28 vòng kim loại để giữ giấy sát vào thành ống nhựa.
- 2 ống hút (có thể thay bằng ống tuýp 2 đầu).
- Nhiệt kế, ẩm kế, đồng hồ hẹn giờ.
- Biểu mẫu ghi chép số liệu.
c) Điều kiện thử nghiệm
- Phòng thử nghiệm bảo đảm không có tồn dƣ hóa chất diệt côn trùng.
- Nhiệt độ phòng từ 250 C ± 2, độ ẩm từ 80% ± 10%.
- Dụng cụ thử nghiệm phải sạch, khô.
- Muỗi thử nghiệm: Muỗi cái Aedes F1 thu từ bọ gậy bắt tại thực địa. Muỗi từ 2-5 ngày tuổi, chưa hút máu, đã hút nước đường glucoza 10%. Muỗi thử nghiệm phải khỏe mạnh, cơ thể nguyên vẹn.
- Số muỗi thử nghiệm: Mỗi loại hóa chất cần 140 muỗi cái, trong đó 100 muỗi tiếp xúc với hóa chất, 40 muỗi cho tiếp xúc với giấy đối chứng.
d) Quy trình thử nghiệm (WHO/CDC/CPC/MAL/98.12)
Bước 1: Chuẩn bị các ống nghỉ: đặt một tờ giấy trắng sạch cuộn thành hình trụ lồng vào bên trong mỗi ống nghỉ. Dùng vòng kim loại trắng giữ chặt tờ giấy cho sát vào thành ống. Lắp tấm đế vào ống.
Bước 2: Sử dụng ống tuýp 2 đầu bắt muỗi từ trong các lồng muỗi, chọn những con muỗi khỏe mạnh đạt tiêu chuẩn cho vào mỗi ống nghỉ 20 con.
Bước 3: Chuẩn bị ống đối chứng và ống thử nghiệm: Dùng tờ giấy đối chứng cuộn thành hình trụ lồng vào mỗi ống trứng và chèn vòng kim loại giữ giấy sát vào thành ống. Làm tương tự với giấy tẩm hóa chất.
Bước 4: Chuyển muỗi vào các ống đối chứng và ống thử nghiệm: lắp ống nghỉ vào các ống đối chứng và ống thử nghiệm. Chuyển tấm đế vào giữa lỗ thông giữa 2 ống thông nhau. Thổi nhẹ muỗi từ ống nghỉ sang ống đối chứng trước và ống thử nghiệm sau. Đóng tấm đế lại và tháo ống nghỉ ra.
Bước 5: Để các ống tiếp xúc dựng đứng, phía có lưới hướng lên trên trong thời gian muỗi tiếp xỳc húa chất là 60 phỳt, theo dừi và đếm số muỗi quỵ trong thời gian tiếp xúc (5,10,15,20,30,40,50,60 phút).
Bước 6: Hết thời gian tiếp xúc, chuyển muỗi sang ống nghỉ bằng các bước tiến hành ngược lại ở bước 4. Đặt miếng bông tẩm nước đường glucoza 10%
lênphía trên mặt lưới của ống nghỉ.
Bước 7: Giữ ống nghỉ trong 24 giờ ở nơi tách biệt, nhiệt độ không quá 300C, theo dừi nhiệt độ và độ ẩm trong suốt quỏ trỡnh thử nghiệm.
Bước 8: Sau 24 giờ tính số muỗi chết ở các lô thí nghiệm. Con muỗi nào không bay đƣợc thì coi là muỗi chết dù chân, cánh, pan, vòi vẫn cử động đƣợc. Ghi kết quả vào phiếu.
e) Đánh giá kết quả thử nghiệm
- Tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng lớn hơn 20% thì kết quả thử nghiệm bị huỷ, và làm lại thử nghiệm.
- Nếu tỷ lệ muỗi chết của lô đối chứng < 5%: giữ nguyên tỷ lệ chết của lô tiếp xúc với hóa chất.
- Nếu tỷ lệ muỗi chết của lô đối chứng trong khoảng 5% - 20% thì tỷ lệ muỗi chết trong lô thử nghiệm sẽ đƣợc điều chỉnh bằng công thức Abbott:
Công thức Abbott:
% chết thí nghiệm - % chết đối chứng
Tỷ lệ chết = x 100 100 - % chết đối chứng
Sau 24 giờ, căn cứ trên tỷ lệ muỗi chết để đánh giá tính nhạy, kháng của muỗi với hóa chất thử.
- Tỷ lệ muỗi chết từ 98%-100%: Muỗi còn nhạy cảm với hóa chất thử.
- Tỷ lệ muỗi chết từ 80% - 97%: Muỗi tăng sức chịu đựng với hóa chất tại nồng độ thử.
- Tỷ lệ muỗi chết < 80%: Muỗi kháng với hóa chất tại nồng độ thử.
2.4.1.4. Phương pháp vẽ ban đồ kháng hóa chất của muỗi Aedes
- Số liệu về độ nhạy cảm của muỗi Aedes đƣợc nhập vào phần mềm Excell 2010.
- Sử dụng phần mềm Arcgis 9.3 để vẽ bản đồ nhạy cảm với hóa chất thử của muỗi Aedes.
2.4.2. Phương pháp phân tích mối tương quan giữa một số yếu tố sinh thái với các chỉ số muỗi và bọ gậy Ae. aegypti
Thực hiện theo phương pháp của Glen Sia Su [50].
- Trong nghiên cứu này chúng tôi xem xét mối tương quan giữa các nhân tố nhiệt độ, độ ẩm, lƣợng mƣa với chỉ số mật độ muỗi (MĐM) và chỉ số Breteau (BI) của muỗi Ae. aegypti ở 20 xã (phường) trọng điểm về SXHD tại Hà Nội.
2.4.2.1 Dữ
liêu
nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa
Dữ liệu về nhiệt độ, độ ẩm, lƣợng mƣa hàng tháng đƣợc thu thập từ Trung tâm nghiên cứu Khí hậu-Khí tƣợng, Đài khí tƣợng Láng. Những dữ liệu này đƣợc đối chiếu với các chỉ số mật độ muỗi (MĐM) và chỉ số BI của Ae. aegypti để đánh giá mối tương quan.
2.4.2.2. Vật liệu nghiên cứu
Dụng cụ điều tra thu thập muỗi và bọ gậy:
- Tuýp bắt muỗi
- Bông không thấm nước - Đèn pin
- Bút viết trên kính - Phiếu điều tra - Ống hút bọ gậy - Vợt bọ gậy - Lọ đựng bọ gậy
Dụng cụ, vật liệu làm tiêu bản bọ gậy:
- Kim thủy tinh - Lam kính - Lamen - Đĩa petri - Giá đựng lam - Kính hiển vi
2.4.2.3. Xác định các chỉ số mật độ muỗi và chỉ số BI
Tiến hành điều tra cắt ngang mỗi tháng 1 lần vào tuần thứ hai và thứ ba hàng tháng. Các chỉ số muỗi và bọ gậy được xác định theo "Hướng dẫn giám sát và
phòng chống SXHD" và "Tài liệu hướng dẫn phòng chống sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue" của WHO [4, 38].
Thu thập muỗi trưởng thành bằng phương pháp soi bắt muỗi đậu nghỉ trong nhà bằng ống tuýp. Soi bắt muỗi cái đậu nghỉ trên quần áo, chăn màn, các đồ vật trong nhà vào buổi sáng, mỗi nhà soi bắt muỗi trong 15 phút. Muỗi sau khi bắt đƣợc có thể định loại ngay tại thực địa căn cứ trên các đặc điểm về hình thái.
Số nhà điều tra cho mỗi điểm là 30 nhà. Chỉ số đƣợc sử dụng để theo dừi trong nghiên cứu này là chỉ số mật độ muỗi.
Chỉ số MĐM là số muỗi cái Ae. aegypti trung bình trong một gia đình điều
tra. Số muỗi cái Ae. aegypti bắt đƣợc
Chỉ số MĐM (con/nhà) = Số nhà điều tra
Thu thập bọ gậy được thực hiện cùng thời điểm với thu thập muỗi trưởng thành. Sau khi bắt muỗi, tiến hành điều tra bọ gậy bằng quan sát, ghi nhận, thu thập ở toàn bộ DCCN trong và quanh nhà. Bọ gậy tại mỗi DCCN thu thập tương tự phương pháp thu thập để phục vụ thử nhạy cảm đã trình bày ở phần trên. Bọ gậy sau khi thu thập sẽ đƣợc chuyển về phòng thí nghiệm của Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội để tiến hành định loại theo loài. Kết quả định loại sau đó sẽ đƣợc sử dụng để tớnh cỏc chỉ số. Trong nghiờn cứu này chỉ số đƣợc sử dụng để theo dừi là chỉ số BI.
Chỉ số Breteau (BI) là số dụng cụ chứa nước có bọ gậy Ae. aegypti trong 100 nhà điều tra. Tối thiểu điều tra 30 nhà, vì vậy BI đƣợc tính nhƣ sau:
Số DCCN có bọ gậy Ae. aegypti
x 100
BI = Số nhà điều tra
2.4.2.4 Phân tích và xử lý số liệu xác định mối tương quan giữa các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa với các chỉ số MĐM và BI
- Số liệu đƣợc nhập vào phần mềm Excel 2010
- Nhập liệu vào phần mềm SPSS 11.3 để phân tích.
- Phân tích mối tương quan bằng hồi qui tuyến tính qua hệ số tương quan r [1]: Giá trị hệ số tương quan r dao động từ -1 đến 1
Nếu r >0 là tương quan thuận.
Nếu r <0 là tương quan nghịch.
r càng gần ±1 thì tương quan càng chặt.
Bảng 2 2. Giá trị của hệ số tương quan và ý nghĩa
TT Hệ số tương quan r Ý nghĩa
1 ± 0,01 đến ± 0,1 Mối tương quan thấp, không đáng kể
2 ± 0,2 đến ± 0,3 Tương quan thấp
3 ± 0,4 đến ± 0,5 Tương quan trung bình
4 ± 0,6 đến ± 0,7 Tương quan chặt
5 ± 0,8 đến ± 1 Tương quan rất chặt