1.2. Các phương pháp xác định nhóm chất diệt cỏ glyphosate
1.2.2. Phương pháp sắc kí lỏng
1.2.2.5. Phương pháp sắc ký lỏng ết hợp hối phổ Ph n tích g phosate c sử dụng dẫn xuất
Nhóm nhà khoa học R.J. Vreeken và cộng sự [31] đã phát triển phương pháp phân tích nhóm chất diệt cỏ glyphosate sử dụng dẫn xuất h a trước cột FMOC-Cl bằng hệ thống LC-MS/MS.
Nghiên cứu này sử dụng hệ thống HPLC (Perkin – Elmer, Norwalk, CO, USA), pha động nghiên cứu là CH3COONH4 ( 5mM) – ACN, sử dụng cột Inertsil ODS-2 (250 x 4,6 mm, 5 àm) (GL Science, Tokyo, Japan) với tốc độ dòng 1 ml/phút. Chế độ dòng gradient với dòng chứa 10-54% ACN trong vòng 20 phút đầu, sau đ duy trì d ng 90% ACN để rửa giải lƣợng chất dẫn xuất hóa từ cột tách.
Chế độ quét ion h a điện tử (ESI) được lựa chọn cho phương pháp (m/z 50- 500/ s) đƣợc ghi lại trên thiết bị khối phổ Finnigan MAT (San Jose, CA, USA) TSQ 7000. Thiết bị đƣợc khảo sỏt ở chế độ ion õm bằng cỏch bơm vài àl dung dịch polyethyleglycol (PEG, Baker) 10 mg/L trong dung môi methanol: nước (v/v, 1/1) với 0,01M CH3COONH4. Thể tớch bơm vào buồng h a hơi ESI là 200 àL/phỳt, sử dụng bộ chia dòng tốc độ 1 ml/phút đƣợc chia tỷ lệ 200:800. Tốc độ dòng chảy này đƣợc duy trì với những giá trị tối ƣu h a các thông số trong buồng ion hóa áp suất khí quyển (API) nhƣ sau: Nhiệt độ mao dẫn 250oC, thế ion h a điện tử ESI là -3,6 kV, áp suất dòng chảy 75 psi.
Trong quá trình khảo sát các dẫn xuất hóa FMOC-Cl của glyphosate và AMPA, nghiên cứu sử dụng chế độ buồng phun ion h a điện tử full-scan. Dẫn xuất FMOC của cả glyphosate, AMPA, glufosinate đều bị bắn phá tạo thành các mảnh ion lần lƣợt là 390, 332 và 402. Đối với dẫn xuất của glyphosate, hai mảnh ion con được chọn là 168 và 150, tương ứng với ion [(glyphosate-FMOC)-FMOC]- và ion [(glyphosate-FMOC)-FMOC – H2O]-. Đối với AMPA, mảnh ion con đƣợc chọn là 136, tương ứng với ion [(AMPA – FMOC) – FMOC]-. Đối với glufosinate, mảnh ion con được chọn là 180 và 206. Cường độ năng lượng va chạm được tối ưu h alà 25 eV (trong khoảng khảo sát từ 5-40 eV).
Nghiên cứu tiến hành phân tích mẫu nước được dẫn xuất hóa với dung dịch FMOC-Cl cùng đệm borac, để cho phản ứng qua đêm ở nhiệt độ 37oC. Phản ứng dẫn xuất hóa kết thúc khi cho một lƣợng axit photphoric là pH giảm.Mẫu sau khi dẫn xuất h a đƣợc phân tích bởi hệ thống LC-MS/MS.
Khoảng tuyến tính của phương pháp được xây dựng trong khoảng từ 0,05-3 àg/L với hệ số hồi quy tuyến tớnh lớn hơn 0,998. Giới hạn phỏt hiện LOD cho cả glyphosate và AMPA là 0,03 àg/L; giới hạn định lƣợng LOQ đƣợc xỏc định là 0,05 àg/L cho nước uống, nước bề mặt và nước thải. Độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại và độ tái lặp đối với glyphosate khi phân tích mẫu nước được thêm chuẩn ở nồng độ 0,2 àg/L là <6% (với số lần lặp lại thớ nghiệm n=6) và <9% (với số lần lặp lại thí nghiệm n=16). Đối với AMPA, các thông số này cao hơn, lần lƣợt là <9%
(với số lần lặp lại thí nghiệm n=6) và <10% (với số lần lặp lại thí nghiệm n=16). Độ thu hồi của cả glyphosate và AMPA trong nước uống cũng như nước bề mặt đều lớn hơn 94% (với số lần lặp lại thí nghiệm n=16).
Phương pháp phân tích nh m chất diệt cỏ glyphosate bằng hệ thống LC- MS/MS sử dụng dẫn xuất hóa FMOC-Cl đạt kết quả tốt. Tuy nhiên, một trong những bất lợi của việc sử dụng dẫn xuất FMOC-Cl là sẽ tạo một hợp chất FMOC- OH gây nhiễu cho quá trình phân tích, khiến kết quả thu đƣợc đạt tín hiệu không như mong muốn. Xuất phát từ lý do đ , một phương pháp phân tích trực tiếp glyphosate đƣợc nghiên cứu.
Ph n tích g phosate trực tiếp
Phân tích c iếp glyphosate bằng phương pháp LC-ICP-MS
Nhóm các nhà khoa học Maximilian Popp, Stephan Hann và các cộng sự đã nghiên cứu một phương pháp mới sử dụng sắc ký cation kết hợp với nguồn cảm ứng cao tần plasma kết nối khối phổ (LC-ICP-MS) để xác định đồng thời nhóm thuốc diệt cỏ glyphosate và AMPA trong mẫu nước thải và nước bề mặt [25]. Phương pháp sử dụng hệ thống sắc ký ion DX-500 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA), cột tách đƣợc sử dụng là cột trao đổi cation gồm tiền cột (cột bảo vệ) có thông số 4 x 20mm và cột phân tích có thông số 4 x 150 mm. Pha động sử dụng gồm KCl 10 mmol/L
và HCl 10 mmol/L, chế độ rửa giả đẳng dòng. Tốc độ dòng là 0,5 ml/phút, thể tích bơm là 50àL.
Nghiên cứu sử dụng cột chiết pha rắn SPE để làm giàu mẫu phân tích. Cột chiết pha rắn đƣợc nhồi bởi nhựa Chelex 100 hoặc nhựa trao đổi anion AG1-X8.
Mẫu phân tích đƣợc lọc qua màng lọc cellulose và sử dụng axit HCL 6M để chỉnh ở khoảng pH 2 ± 0,1. Sau đ , cho 220ml mẫu phân tích cho qua cột chiết với tốc độ 6 ml/phút. Dung dịch rửa được sử dụng là 20 ml nước và 40 ml HCl 0,02M. Các chất phân tích sau đ đƣợc rửa giải từ từ qua hai loại nhựa Chelec và AG1-X8 với dung dịch HCl 10M. Thu 50 ml dung dịch rửa giải, sau đ thổi khô ở điều kiện nhiệt độ 55oC, áp suất 50 mbar. Dƣ lƣợng chất rắn sau khi thổi khô đƣợc hòa tan bằng 500 àL dung dịch rửa giải (gồm KCl 10 mmol/L và HCl 10 mmol/L).
Nghiên cứu này cũng thực hiện lấy mẫu nước thải vào mùa hè năm 2005 và mùa xuân năm 2006 tại ba nhà máy xử lý nước thải và một khu công nghiệp ở Vorarlberg, cộng hòa Áo. Đối với nhà máy xử lý nước thải thứ nhất có 80%
nước thải có nguồn gốc từ kim loại, thực phẩm hoặc công nghiệp dệt may. Đối với nhà máy xử lý nước thải thứ hai và thứ ba chỉ c 30% nước thải có nguồn gốc từ các khu công nghiệp, chủ yếu là sản xuất dệt may.
Mẫu nước môi trường được phân tích bằng hệ thống HPIC-ICP-MS, glyphosatevà AMPA có thời gian lưu lần lượt là 5,2 phút và 7,9 phút. Ở môi trường pH của dung dịch rửa giải, các chất cần phân tích đƣợc proton hóa nhóm chức amino để dễ dàng trao đổi cation. Kết quả thực nghiệm cho độ thu hồi của glyphosate và AMPA lần lƣợt là 103% và 104%, giới hạn phát hiện lần lƣợt là 42 àg/L và 33 àg/L.
Do hàm lượng tối đa cho phép của nhóm chất diệt cỏ glyphosate trong nước chỉ là 0,1 àg/L nờn yờu cầu một phương phỏp làm giàu mẫu hiệu quả. Trong nghiờn cứu này, các nhà khoa học cũng đã tiến hành đánh giá hiệu quả chiết và làm giàu mẫu trên cột chiết pha rắn amin 500 mg. Tuy nhiên, kết quả phân tích cho thấy việc sử dụng cột chiết này chỉ có hiệu quả đối với việc làm giàu glyphosate, hiệu suất thu hồi đối với AMPA rất kém. Vì vậy, các nhà khoa học vẫn quyết định lựa chọn cột
chiết pha rắn có chứa bột nhồi Chelex 100. Phương pháp phân tích sử dụng hệ thống HPIC-ICP-MS kết hợp với phương phỏp làm giàu mẫu cho phộp theo dừi hàm lượng glyphosate và AMPA trong mẫu nước môi trường. Glyphosate và AMPA được tỡm thấy trong mẫu nước phõn tớch lần lượt là 0,67 àg/L và 2,8 àg/L, điều này chứng tỏ các nhà máy xử lý nước thải đã không loại bỏ glyphosate và AMPA một cách hiệu quả trong quá trình xử lý nước.
h n ch gl phosa e ằng sắc k ương ác ưa nước (HILIC)
Đề xuất một phương pháp phân tích trực tiếp không qua quá trình dẫn xuất c ý nghĩa khoa học và thực tiễn rất lớn nhưng cũng là một thách thức cho người nghiên cứu và phát hiện phương pháp phân tích.Trong những năm gần đây, sắc kí tương tác ưa nước HILIC (Hydrophilic Interation Liquid Chromatography) cũng đƣợc cộng đồng khoa học đặc biệt quan tâm do có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm, sinh học, y sinh, môi trường, an toàn thực phẩm… Trong thế hệ cột sắc kí HILIC mới ra đời, loại cột chứa ligand zwitterion có nhiều tính năng đặc biệt nhƣ phân tích đồng thời cả cation, anion và các hợp chất trung h a điện nhƣ cột ZIC- cHILIC, Obelisc N (cột tách đa cơ chế đƣợc chế tạo theo công nghệ tế bảo) có khả năng tách những hợp chất nhỏ c độ phân cực rất cao nhƣ glyphosate.
Phương pháp phân tích glyphosate và các dạng chuyển hóa của nó sử dụng cột sắc kí tách ưa nước HILIC mà không cần sử dụng chất dẫn xuất hóa FMOC-CI đƣợc các nhà khoa học Hàn Quốc nghiên cứu trên mẫu máu đƣợc thu thập từ 5 bệnh nhân nhiễm độc glyphosate tại phòng cấp cứu của một bệnh viện từ tháng 02/2015 đến tháng 07/2015 [22].
Nghiên cứu mô tả năm trường hợp bệnh nhân nhiễm độc glyphosate:
-Trường hợp 1: Một bệnh nhân nam 58 tuổi sử dụng 300 ml glyphosate để tự tử. Tại thời điểm nhập viện, bệnh nhõn khụng tỉnh tỏo và đƣợc đặt nội khớ quản.Theo dừi sự chuyển hóa nhiễm toan ở bệnh nhân (tình trạng hàm lƣợng axit vƣợt quá mức trong cơ thể), sau đ rút ổng khí quản. Bệnh nhân đƣợc rời phòng cấp cứu sau khi tình trạng bệnh đƣợc cải thiện.Thực hiện xét nghiệm mẫu máu của bênh nhân 3 giờ sau khi uống glyphosate.
-Trường hợp 2: Một bệnh nhân nam 75 tuổi đã dùng 200 ml glyphosate để tự tử. Tại thời điểm nhập viện, bệnh nhân tỉnh táo nhƣng bị nôn và đau họng. Bệnh nhân đƣợc điều trị nội trú, chụp X - quang cho thấy bị viêm phổi. Sau đ bệnh nhân đƣợc chuyển đến khoa phổi nhƣng đã chết do hội chứng suy hô hấp cấp tính. Thực hiện xét nghiệm mẫu máu của bệnh nhân sau 2 giờ uống glyphosate.
-Trường hợp 3: Một bệnh nhân nam 64 tuổi uống nhầm khoảng 180 ml glyphosate.
Thời điểm nhập viện, bệnh nhõn tỉnh tỏo.Theo dừi và điều trị, tỡnh trạng bệnh nhõn tốt hơn và đƣợc xuất viện. Thực hiện xét nghiệm mẫu máu của bệnh nhân sau 5 giờ uống glyphosate
-Trường hợp 4: Một bệnh nhân nam 82 tuổi tự sát bằng cách uống 40ml glyphosate.
Sau khi uống, bệnh nhân có dấu hiệu nôn mửa.Tại thời điểm nhập viện, bệnh nhân tỉnh táo, bệnh nhân đƣợc chẩn đoán bị viêm phổi và đƣợc điều trị đồng thời với thuốc kháng sinh.Sau khi dùng kháng sinh liên tục, tình trạng bệnh khá hơn và đƣợc xuất viện, Thực hiện xét nghiệm mẫu sau 5 giờ uống glyphosate.
-Trường hợp 5: Một bệnh nhận nam cố tình tự tử bằng cách uống một ngụm glyphosate (khoảng 50 ml). Vào thời điểm nhập viện, bệnh nhân tỉnh táo, có dấu hiệu nôn mửa.Bệnh nhân đƣợc điều trị và chăm s c, khi tình trạng sức khỏe đƣợc cải thiện, bệnh nhân đƣợc cho phép xuất viện.Thực hiện xét nghiệm mẫu máu sau 5 giờ uống glyphosate, không tìm thấy dấu hiệu bất thường nào trong kết quả xét nghiệm.
Phương pháp này sử dụng cột mixed-mode HILIC-1 (150mm, 2.1mm I.D, 3àm), pha động c acetonitrile và nước chứa 0,3% axit formic, tốc độ pha động là 0,5ml/phút, chương trình chạy gradient được thiết lập như sau: Từ 0-3 phút đầu tiên 20-5% ACN, từ 3-4 phút: 5% ACN, từ 4-7 phút: 5-95% ACN, từ 7-8 phút: 95%
ACN, từ 8-9 phút tỉ lệ ACN giảm dần từ 95 xuống 20%, từ 9-11 phút để cột cân bằng với 20% ACN. Nghiên cứu này sử dụng cột chiết pha rắn Oasis MAX SPE để chiết mẫu. LOD và LOQ của phương pháp đối với glyphosate và AMPA lần lượt là 50 àg/L và 100 àg/L. Độ thu hồi cho glyphosate và AMPA trong nền mẫu mỏu đạt đƣợc từ 82,3% đến 89,1%.
A.M. Botero-Coy cùng cộng sự [10] cũng phân tích hàm lƣợng nhóm chất glyphosate bằng LC-MS/MS sử dụng cột sắc kí tương tác ưa nước HILIC Obelisc N. Phương pháp sử dụng cột tách Obelisc N và phân tích glyphosate trên các nền mẫu gạo, ngô và đậu. Đối với các nền mẫu, mẫu đƣợc cân một lƣợng chính xác, thêm dung môi chiết và sử dụng cột chiết pha rắn SPE Oasis HLB (60 mg). Mẫu sau khi chiết đƣợc phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS sử dụng cột tách sắc kí ƣa nước Oblisc N (5 àm x 2.1 mm x 100 mm).
Độ chụm và độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua độ thu hồi các kết quả thí nghiệm phân tích trên ba nền mẫu gạo, ngô và đậu tương ở các mức thêm chuẩn 0,1 và 1 mg/kg đối với gạo và ngô, 2 và 20 mg/kg đối với đậu tương (lƣợng chuẩn thêm vào đƣợc tính toán phù hợp với giới hạn cho phép của glyphosate trên các nền mẫu gạo, ngô, đậu tương lần lượt là 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 20 mg/kg). Phương pháp này được phân tích khảo sát trên 21 mẫu (gồm 7 mẫu gạo, 2 mẫu lúa mạch, 6 mẫu ngô, 5 mẫu đậu tương, 1 mẫu đậu Hà Lan) được lấy từ những vùng khác nhau ở Nam Mỹ và Tây Ban Nha. Để kiểm soát quá trình phân tích, các nhà khoa học đã sử dụng mẫu trắng đƣợc thêm chuẩn ở mức hàm lƣợng 0,5 mg/kg (riêng đối với mẫu đậu tương là 10 mg/kg). Phân tích lặp lại 5 lần, độ thu hồi của mẫu kiểm soát nằm trong khoảng 80-110%.
Kết quả của phương pháp phân tích cho khoảng thu hồi từ 77-84% cho gạo, 85-100 cho ngô và 89-96% cho đậu tương, độ lệch chuẩn tương đối RSD <17%.
Giới hạn định tính là 0,007 mg/kg; 0,008 mg/kg; 0,12 mg/kg lần lƣợt cho ngô, gạo và đậu tương. Giới hạn định lượng là 0,02 mg/kg; 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg lần lượt cho ngô, gạo và đậu tương.
Tuy nhiên, phương pháp phân tích glyphosate bằng hệ thống LC-MS/MS sử dụng cột sắc kí ưa nước Obelisc N có một vài hạn chế. Cột Obelisc N bị hỏng rất nhanh, các nhà khoa học đã phải sử dụng đến ba chiếc cột Obelisc N để phân tích 20 mẫu khảo sát. Thời gian lưu của glyphosate trên một cột Obelisc N mới trong khoảng 7 phút, tuy nhiên thời gian lưu này nhanh ch ng bị giảm xuống chỉ còn 3 phút sau khoảng 100 lần tiêm mẫu qua cột, hình dạng pic thu đƣợc xấu đi rất nhiều.
Đối với nền mẫu càng phức tạp, nguy cơ hỏng cột càng cao, vì vậy bước làm sạch trong quá trình chiết rất quan trọng đối với tuổi thọ của cột phân tích. Trong quá trình khảo sát này, cứ sau 60 mũi tiêm, thực hiện rửa cột H2O:ACN (50/50 v/v) chứa 10 mM HCOONH4 ở tốc độ dòng 0,1 ml/phút trong 4 giờ.
Một nhóm các nhà khoa học khác khác Ming-Xue Chen, Zhao-Yun Cao, Yan Jiang và Zhi-Wei Zhu đã nghiên cứu phân tích trực tiếp glyphosate và các dạng chuyển h a của n trong mẫu trái cây và rau quả bằng phương pháp chế độ tương tác ưa nước, sắc kí lỏng trao đổi anion yếu kết hợp với đầu d hai lần khối phổ [28].
Nghiên cứu này kết hợp hai điều kiện thuận lợi nhất của hai cơ chế phân tách khác nhau: glyphosate và AMPA được giữ lại tốt trên cột tương tác ưa nước trao đổi anion yếu HILIC/WAX, các hợp chất c khả năng gây nhiễu đã đƣợc loại bỏ trong chế độ tương tác ưa nước HILIC, cách chất cần phân tích được rửa giải một cách hiệu quả trong chế độ trao đổi anion yếu WAX, sau đ phân tích trực tiếp bằng hệ thống HPLC-ESI-MS-MS.
Trong nghiên cứu này, hệ thống HPLC-ESI-MS-MS với chế độ ion âm và cột sắc kí Asahipak NH2P-50 4E đƣợc lựa chọn để phân tích trực tiếp glyphosate và AMPA trên mẫu trái cây và rau quả. Thiết lập tốc độ d ng 0,3 ml/phút, nhiệt độ cột ở 30oC, thể tớch bơm mẫu là 25 àL. Pha động gồm ba kờnh A, B, C với cỏc dung mụi lần lượt là: kênh A (nước), kênh B (acetonitrile), kênh C (nước chứa NH4OH 0,1 mol/L). Chế độ gradient nhƣ sau: từ 0-10 phút đầu tiên 90% dung môi kênh A và 10% dung môi kênh B; từ 10-10,1 phút 85% dung môi kênh A và 15% dung môi kênh B; từ 10,1-45 phút 30% dung môi kênh B và 70% dung môi kênh C; từ 45- 45,1 phút 5% dung môi kênh B và 95% dung môi kênh C; từ 45,1-50 phút 5% dung môi kênh B và 95% dung môi kênh C; từ 50-50,1 phút 90% dung môi kênh A và 10% dung môi kênh B, cột được cân bằng lại trong v ng 20 phút trước khi bơm mũi tiếp theo. Nghiên cứu xác định sự chuyển tiếp MRM tối ƣu cho glyphosate và AMPA đƣợc thực hiện bằng chế độ quét toàn bộ MS, đối với glyphosate các mảnh đƣợc chọn lọc là 168 → 63 và 168 → 79, đối với AMPA các mảnh đƣợc chọn lọc là 110→ 63 và 110→ 79.
Các nhà khoa học đã nghiên cứu một số phương pháp đánh giá việc làm sạch các chất phân tích khi sử dụng các cột chiết pha rắn c chất hấp thụ khác nhau nhƣ cột chiết pha rắn MAX và MCX (60 mg, Waters), cột Bio-Rad CAX (AG50W-X8, dạng H+, Hoa Kỳ), cột AccuBond ODS-C18 (6 ml, 500 mg, Agilent), cột PWAX Poly-sery (6 ml, 500 mg). Các nhà khoa học cũng đồng thời nghiên cứu khả năng tách chất phân tích trên các cột tương tác ưa nước khác nhau như cột ZIC-HILIC ( 150mm ì 2,1mm ì 3,5àm, Meck), cột Kinetex HILIC (150 mm ì 2,1 mm ì 2,6 àm, Phenomenex), cột Obelisc N (150 mm ì 2,1 mm ì 5 àm), cột Zorbax NH2
(250 mm ì 4,6 mm ì 5 àm, Agilent) và cột Asahipak NH2P-50 4E (250 mm ì 4,6 mm ì 5 àm, Shodex).Trong đ , cột sắc kớ Asahipak NH2P-50 4E và cột chiết pha rắn WAX đƣợc sử dụng đồng thời để phân tích hàm lƣợng nh m chất diệt cỏ glyphosate trong thực phẩm.
Phương pháp nghiên cứu c giới hạn phát hiện của glyphosate và AMPA lần lƣợt 1,2 àg/kg và 15 àg/kg; giới hạn định lƣợng của glyphosate và AMPA lần lượt là 5 àg/kg và 50 àg/kg, hệ số tương quan tuyến tớnh lớn hơn 0,9966. Độ thu hồi của phương pháp phân tích glyphosate và AMPA ở các nồng độ lần lượt là 75,3% - 110% và 76,1% -110%, độ lệch chuẩn tương đối đạt 1,1 -13,8%. Độ chụm đạt đƣợc khi phân tích lặp lại 7 lần mẫu rau và trái cây trong ngày đạt 5,9% -7,5%, khi phân tích lặp lại 11 lần mẫu rau và trái cây giữa các ngày đạt 7% -13%.