2.2. Pha dung dịch chuẩn
2.3.3. Quy trình phân tích glyphosate và các dẫn xuất của nó
Việc phân tích glyphosate trực tiếp bằng hệ thống LC-MS/MS sử dụng cột tách sắc kí ion tối ưu được hai điều kiện là không cần chất dẫn xuất h a trước cột và quá trình chiết mẫu đƣợc tối giản. Việc sử dụng chất dẫn xuất hóa trong quá trình xử lý mẫu thường c nguy cơ bị ion hóa, mẫu phân tích thường có nồng độ thấp nên khi sử dụng dẫn xuất cho hiệu suất thu hồi không cao. Phân tích trực tiếp glyphosate bằng LC-MS/MS cho phương pháp nhạy cao và cột tách lưu giữ được chất cần phân tích.Để khắc phục nhược điểm của phương pháp phân tích sắc kí sử dụng dẫn xuất hóa FMOC-Cl và phương pháp phân tích trực tiếp sử dụng sắc kí tách ưa nước HILIC, phương pháp phân tích nh m chất glyphosate sử dụng cột trao đổi cation Dionex ionPAC CS12A đƣợc đề xuất.
Nghiên cứu này thực hiện khảo sát quy trình phân tích mẫu nước và mẫu thực phẩm sử dụng các loại cột chiết pha rắn là cột chiết pha rắn không phân cực C18, cột chiết pha rắn HLB, cột chiết pha rắn Hybrid, cột chiết pha rắn trao đổi ion mixed-mode MAX và PAX. Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích trên từng nền mẫu và trên từng cột chiết pha rắn được trình bày cụ thể dưới đây:
Quy trình chuẩn bị mẫu nước
Mẫu nước sau khi lọc, được bảo quản ống nghiệm nhựa ở -20oC. Mẫu phải được đưa về nhiệt độ ph ng trước khi đem đi phân tích. Mẫu phân tích cho thêm nội chuẩn và để cân bằng ít nhất 1 giờ trước khi phân tích. Cho 100ml mẫu nước qua cột chiết pha rắn SPE MAX 30 mg/1cc. Cột SPE MAX được hoạt hóa bằng 3ml MeOH, 3 ml nước deion và 3ml dung dịch NH3 1%. Cho dung dịch chiết qua cột SPE MAX, sau đ rửa lặp lại ba lần, mỗi lần rửa bằng 1 ml dung dịch NH3 1%. Rửa giải bằng 1 ml dung dịch acetonitrile chứa HCOOH 5%.
Dung dịch thu được được thổi khô dưới dòng khí N2, sau đ h a lại bằng 1ml nước deion và được phân tích bằng LC-MS/MS.
Quy trình chuẩn bị mẫu th c phẩm (nền ngũ cốc)
Quy trình phân tích sử dụng cột chiết pha rắn Waters HLB (hydrophilic lipophilic balance) và cột chiết pha rắn C18
Cân 0,25 gam mẫu ngũ cốc, chính xác đến ±0,1mg đã đƣợc đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm 50 ml. Cho 4 ml dung dịch chiết vào ống phân tích (dung dịch chiết gồm 50mM CH3COOH/ 10mM Na2EDTA). Lắc ống mẫu phân tích trong 10 phút với tốc độ 2000 v ng/phút, sau đ ly tâm mẫu phân tích ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút. Thu 3 ml dịch chiết lớp trên đem cho qua cột chiết pha rắn SPE.
Đối với cột HLB: Dịch chiết đƣợc cho qua cột SPE Oasis HLB 100 mg/6cc. Cột SPE HLB Oasis được hoạt hóa bằng 2 ml MeOH, 2 ml nước deion và 2 ml dung dịch chiết (50 mM CH3COOH/ 10 mM Na2EDTA). Cho 3 ml dịch chiết qua cột HLB, bỏ 2 ml dung dịch chảy qua cột ban đầu, sau đ thu 1 ml dịch chiết cuối cùng vào vial. Mẫu đƣợc phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS.
Đối với cột C18: Dịch chiết đƣợc cho qua cột C18. Cột SPE C18 đƣợc hoạt hóa bằng 2ml MeOH, 2ml nước deion và 2ml dung dịch chiết (50mM CH3COOH/ 10mM Na2EDTA). Cho 3ml dịch chiết qua cột C18, bỏ 2 ml dung dịch chảy qua cột ban đầu, sau đ thu 1 ml dịch chiết cuối cùng vào vial. Mẫu đƣợc phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS.
Quy trình phân tích sử dụng cột chiết pha rắn Hybrid
Cân 0,25 gam mẫu ngũ cốc, chính xác đến ±0,1mg đã đƣợc đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm 50 ml. Cho 4 ml dung dịch chiết vào ống phân tích (dung dịch chiết gồm 50 mM CH3COOH/ 10 mM Na2EDTA). Lắc ống mẫu phân tích trong 10 phút với tốc độ 2000 v ng/phút, sau đ ly tâm mẫu phân tích ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút. Thu 1 ml dịch chiết lớp trên đem cho qua cột chiết pha rắn SPE. Dịch chiết đƣợc cho qua cột HybridSPE 30 mg/1cc. Cột HybridSPE đƣợc hoạt hóa bằng 2 ml acetonitrile chứa 1% axit fomic. Cho 1 ml dịch chiết qua cột Hybrid, rửa giải bằng 1 ml NH3 1%. Mẫu đƣợc phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS.
Quy trình phân tích sử dụng cột chiết pha rắn Agilent PAX (polymeric mix-mode anion exchange), MAX (mix-mode anion exchange)
Đối với mẫu gạo:
Cân 0,25 gam mẫu gạo chính xác đến ±0,1 mg đã đƣợc đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm 50 ml. Cho 4 ml nước đề ion vào mẫu phân tích. Lắc ống mẫu phân tích trong 10 phút với tốc độ 2000 vòng/phút, sau ly tâm mẫu phân tích ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút. Thu toàn bộ dịch chiết đã đƣợc lọc, điều chỉnh dịch chiết đến pH nằm trong khoảng 8-9 bằng dung dịch NH3 1%, sau đ làm sạch bằng cột SPE MAX 30mg/1cc.
Cột SPE MAX được hoạt hóa bằng 3 ml MeOH, 3 ml nước deion và 3 ml dung dịch NH3 1%. Cho dung dịch chiết qua cột SPE MAX, sau đ rửa lặp lại ba lần, mỗi lần rửa bằng 1ml dung dịch NH3 1%. Rửa giải bằng 1 ml dung dịch acetonitrile chứa HCOOH 5%. Dung dịch mẫu thu được được thổi khô dưới dòng khí N2, sau đ h a lại bằng 1ml nước deion và phân tích bằng LC-MS/MS.
Đối với mẫu ngô:
Cân 0,25 gam mẫu ngô chính xác đến ±0,1 mg đã đƣợc đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm 50 ml. Cho 4 ml nước đề ion, 2 ml dung dịch diclometan (DCM) vào ống phân tích. Để ống phân tích cân bằng trong 30 phút ở nhiệt độ ph ng, sau đ lắc ống mẫu phân tích trong 10 phút với tốc độ 2000 vòng/phút, ly tâm mẫu phân tích ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút. Sau khi ly tâm, hút toàn bộ lớp dịch chiết phía trên, thêm tiếp 2 ml acetonitril vào dịch chiết thu đƣợc và để đông đá ở nhiệt độ - 30oC trong 2 giờ. Sau 2 giờ, đặt ống phân tích ở nhiệt độ ph ng cho đến khi rã đông hoàn toàn, đem dịch chiết đi ly tâm lạnh ở 3000 vòng trong 5 phút. Sau ly tâm, loại bỏ phần cặn rắn, dung dịch mẫu thu được được thổi khô dưới dòng khí N2 đến khi acetonitrile bay hết, định mức bằng nước deion đến thể tích dịch chiết ban đầu. Toàn bộ dịch chiết đƣợc điều chỉnh đến pH nằm trong khoảng 8-9 bằng dung dịch NH3
1%, sau đ làm sạch bằng cột SPE PAX 200mg/6cc.
Cột SPE PAX được hoạt hóa bằng 5 ml MeOH, 5 ml nước deion và 5 ml dung dịch NH3 1%. Cho dung dịch chiết qua cột SPE PAX, sau đ rửa lặp lại ba lần, mỗi lần rửa bằng 2 ml dung dịch NH3 1%. Rửa giải bằng 1 ml dung dịch acetonitrile chứa HCOOH 5%. Dung dịch mẫu thu được được thổi khô dưới dòng khí N2, sau đ h a lại bằng 1 ml nước deion và phân tích bằng LC-MS/MS.
Phân tích nhóm chất diệt cỏ glyphosate trên các cột chiết pha rắn đƣợc đề cập ở trên cho kết quả khác nhau. Cụ thể, kết quả phân tích nhóm chất glyphosate sử dụng cột chiết pha rắn C18, HLB và Hybrid trên nền mẫu nước và thực phẩm rất kém, ngƣợc lại phân tích nhóm chất này sử dụng cột chiết pha rắn mixed-mode MAX và PAX cho kết quả tốt. Vì vậy, để đảm bảo độ nhạy và tính chọn lọc cho các chất cần phân tích, chúng tôi lựa chọn quy trình tối ƣu cho các mẫu phân tích sử dụng cột chiết pha rắn đa cơ chế mixed-mode MAX và PAX cho từng đối tƣợng mẫu cụ thể. Quy trình phân tích sử dụng cột chiết pha rắn đa cơ chế đƣợc trình bày ở Hình 2.5 dưới đây:
Hình 2.2.. Quy trình phân tích nhóm chất diệt cỏ glyphosate trên các nền mẫu
2.3.4. Thẩm định phương pháp