Chuẩn bị 6 dung dịch chuẩn cú nồng độ từ 10àg/L tới 200àg/L bơm vào hệ thống LC-MS/MS trong điều kiện đã đƣợc tối ƣu h a. Mỗi mẫu bơm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần. Diện tích pic trung bình của chất phân tích đƣợc biểu diễn là một hàm của nồng độ chất phân tích dựa trên bước chuyển cho tín hiệu cao nhất.Giới hạn định lượng LOD và giới hạn định tính LOQ được tính tương ứng là 3*S/N và 10*S/N (trong đ S là tín hiệu phân tích, N là tín hiệu nhiễu). Kết quả thu đƣợc trình bày trong bảng 3.11
Bảng 3.11. Giới hạn định tính, giới hạn định lượng của phương pháp ph n ch glyphosate bằng LC-MS/MS
STT Chất phân tích
Thời gian ƣu (phút)
Hệ số tương quan
LOD (àg/L)
LOQ (àg/L)
LODa (pg)
LOQa (pg)
1 Glyphosate 1,55 0,994 2,0 6,0 20,0 60,0
2 AMPA 2,12 0,993 3,0 10,0 30,0 100
3 Glufosinate 3,21 0,988 5,0 16,0 50,0 160
4 3PA 1,94 0,986 4,0 13,0 40,0 130
Dựa vào kết quả trong Bảng 3.11, bỏ qua ảnh hưởng của nền mẫu và sự mất mẫu trong quá trình phân tích, không cần làm giàu mẫu, phương pháp phân tích LC- MS/MS c đủ độ nhạy về phân tích trực tiếp nhóm chất diệt cỏ glyphosate trong mẫu thực không qua giai đoạn dẫn xuất hóa.
3.3.. Độ chính xác ( độ đúng và độ chụm)[5], [6]
Hiệu suất thu hồi và hiệu ứng ức chế quá trình ion hóa
Chiết các hợp chất diệt cỏ họ glyphosate và các dẫn xuất của nó bằng phương pháp chiết rắn-lỏng và làm sạch bằng chiết pha rắn và phân tích bằng LC- ESI- MS/MS.
Hai yếu tố quan trọng cần đánh giá và tối ƣu h a là hiệu suất chiết và hiệu ứng ức chế quá trình ion hóa (ionization suppression) trong nguồn ion hóa của máy phổ khối lƣợng, đặc biệt là nguồn ion h a phun điện tử (Electrospray ionization source: ESI). Có rất nhiều phương pháp để đánh giá đồng thời hai yếu tố này. Các phương pháp và kỹ thuật cụ thể được mô tả rất kỹ ở trong hai công trình đã công bố, được coi là những nghiên cứu tiên phong trong đánh giá cụ thể từng bước của quá trình xử lý mẫu và đo tín hiệu phân tích trên hệ LC-ESI-MS/MS [13] [14] [20]
[23]. Trong luận văn này, hiệu suất chiết và ức chế quá trình ion h a đƣợc nghiên cứu thông qua thí nghiệm thêm chuẩn chất nội chuẩn trước và sau khi chiết của quá trình chuẩn bị mẫu theo sơ đồ khối nhƣ đƣa ra trong Hình 3.16 sau:
Hình 3.16. Sơ đồ khối mô tả thí nghiệm thêm chuẩn đánh giá hiệu suất chiết và hiệu ứng ức chế quá trình ion hóa trong nguồn ion hóa ESI.
Dựa vào sơ đồ khối trên, nếu gọi diện tích của píc các chất nội chuẩn thu được với mẫu thêm chuẩn trước khi chiết là A, sau khi chiết là B và nội chuẩn chuẩn bị trong dung môi tinh khiết (cụ thể trong nghiên cứu này là trong nước deion) là C. Lƣợng chất tuyệt đối thêm chuẩn vào từng giai đoạn là giống nhau thì có thể tính đƣợc hiệu suất chiết, hiệu ứng ức chế quá trình ion hóa và hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình theo công thức sau
Dựa vào hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình và hiệu suất của các hiệu ứng riêng lẻ có thể cho thấy hiệu ứng nào đ ng g p chính tới hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình. Điều này thực sự quan trọng trong phát triển và tối ưu phương pháp phân tích vì nó chỉ ra đúng hiệu ứng mà cần phải thay đổi, tối ƣu h a để cải thiện hiệu suất thu hồi tổng số. Áp dụng sơ đồ khối và công thức tính toán trên cho qui trình xử lý và phân tích glyphosate và các dẫn xuất của nó trong mẫu dựa trên nền mẫu ngũ cốc.
Kết quả thực nghiệm trình bày trong bảng 3.12 nhƣ sau.
Bảng 3.12 . Diện tích píc và hiệu suất từng giai đoạn và toàn bộ quá trình phân tích
TT
Chất phân tích
Diện tích píc (counts) Hiệu suất (%) Thêm
trước khi chiết
Thêm sau khi chiết
Trong pha động
Quá trình chiết
Hiệu ứng ion
hóa
Toàn bộ quá trình
1 GLY 258 562 594 45,9 94,6 43,4
2 GLU 300 477 537 62,9 88,8 55,9
3 3PA 203 268 277 75,7 96,8 73,3
4 AMPA 62 180 226 34,4 80,0 27,4
Nhƣ trình bày trong bảng 3.12 trên, hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình nằm trong khoảng 27,4 % (AMPA) đến 73,3 % (3PA) cho cả bốn chất phân tích. Trong đ hai chất đáng chú ý nhất là AMPA và GLY thì hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình là rất thấp, tương ứng là 27,4 % và 43,4 %. Liên quan tới hiệu suất thu hồi tổng số, hai hiệu ứng liên quan trực tiếp là hiệu suất của quá trình chiết và hiệu ứng xảy ra tại nguồn ion hóa của máy phổ khối lƣợng, đặc biệt là nguồn ion hóa bằng kỹ thuật phun điện tử. Hiệu suất chiết và hiệu ứng ion hóa (hiệu ứng ức chế hoặc tăng cường khả năng ion h a) được tính toán và trình bày trong bảng 3.12. Như kết quả tính toán đã chỉ ra, hiệu ứng ức chế ion hóa xảy ra với tất cả các chất nằm trong
khoảng từ 80,1 % đến 96,8 % (Hiệu ứng ion h a đều nhỏ hơn 100% trong tất cả các trường hợp). Tuy nhiên hiệu ứng ức chế quá trình ion hóa này nằm trong khoảng chấp nhận đƣợc (nằm trong khoảng từ 80 - 120%). Do đ phần đ ng g p của hiệu ứng ức chế ion hóa là rất nhỏ. Trong khi đ , hiệu suất chiết nằm trong khoảng 34,2
% (AMPA) đến 75,7 % (3PA). Trong nghiên cứu này qui trình chiết mẫu bao gồm hai giai đoạn, chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu ngũ cốc và loại bỏ các chất gây ảnh hưởng bằng chiết pha rắn. Một thí nghiệm thêm chuẩn tương tự được thực hiện trước và sau khi làm sạch bằng cột chiết pha rắn đã chỉ ra rằng, hiệu suất chiết được quyết định bởi quá trình chiết, tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu.
Thêm chuẩn ước khi chiết Glyphosate
T ong pha động Glyphosate
AMPA AMPA
GLU GLU
3PA 3PA
Hình 3.17. Sắc đồ các chất phân tích thêm chuẩn ước khi chiết mẫu và trong pha động
Tuy nhiên các hiệu ứng trên đƣợc hiệu chuẩn bằng cách sử dụng chất nội chuẩn đánh dấu đồng vị (13C và 15N). Do đ hiệu suất tương đối của toàn bộ quá trình xử lý mẫu và phân tích là không đổi. Do đ kết quả phân tích không bị ảnh hưởng. Đây chính là ưu điểm nổi bật của phương pháp phân tích bằng phổ khối lượng sử dụng chất nội chuẩn là các hợp chất đánh dấu đồng vị.
Độ chính xác
Độ chụm hay độ lặp lại là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ chụm là một khái niệm định tính và đƣợc biểu diễn định lƣợng bằng độ lệch chuẩn SD hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)
RSD (%) = ì 100
̅
N 2
xi x
SD i 1
N 1
Trong đ :
xi : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i
x : Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm.
N : Số lần thử nghiệm.
Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận. Độ đúng là khái niệm định tính và được biểu diễn định lượng dưới dạng độ chệch (Bias) hoặc hiệu suất thu hồi (recovery)
R(%) = C
c.100 Trong đ :
R: độ thu hồi (%)
C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Nghiên cứu này thực hiện phân tích lặp lại 6 lần nhóm chất glyphosate trên mỗi nền mẫu môi trường và thực phẩm (mẫu trắng, không chứa chất phân tích) được thêm chuẩn tương ứng với mỗi chất glyphosate, AMPA, glufosinate, 3PA là 100àg/kg.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
C
75
Bảng 3.13. Hiệu suất thu hồi, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn ương đối trong các nền mẫu khác nhau
STT
Chất phân tích
Ngô Gạo Nước
Độ lệch chuẩn (SD)
Độ lệch chuẩn tương đối
(RSD%)
Độ thu hồi (R
%)
Độ lệch chuẩn (SD)
Độ lệch chuẩn tương đối
(RSD%)
Độ thu hồi (R
%)
Độ lệch chuẩn (SD)
Độ lệch chuẩn tương đối
(RSD%)
Độ thu hồi (R
%)
1 GLY 8,0 9,1 88,0 13,4 14,8 90,2 4,4 4,6 94,7
2 AMPA 9,7 10,1 95,2 13,4 14,9 89,8 11,9 13,0 91,8
3 GLU 6,5 12,7 51,4 5,2 9,4 55,2 8,8 12,1 72,4
4 3PA 7,6 13,6 55,7 2,7 4,9 54,3 11,1 13,1 84,7
Ghi chú: Quy trình xử lý mẫu nước, mẫu gạo, mẫu ngô như trình bày trong Hình 2.6 (trang 48).
Nhận xét: Bảng 3.13 cho thấy kết quả phân tích mẫu nước môi trường, mẫu gạo và mẫu ngô c độ lặp lại tốt, độ lệch chuẩn tương đối %RSD khi phân tích lặp lại trên các nền mẫu đạt tiêu chí đánh giá về độ lặp lại tối đa chấp nhận được theo tiêu chuẩn AOAC ( <15%) [6]. Độ thu hồi của phép phân tích đạt kết quả tốt, tương đương với nghiên cứu về hiệu suất chiết và hiệu ứng ion h a đã đề cập ở trên. Trong cả ba nền mẫu nghiên cứu, hiệu suất thu hồi của glyphosate và AMPA đạt đƣợc luôn cao hơn glufosinate và 3PA do c sử dụng chất nội chuẩn đánh dấu đồng vị (13C và 15N).
76 3.4. Phân tích mẫu thực tế
Sau khi nghiên cứu các điều kiện tách chiết, chúng tôi tiến hành phân tích trên các mẫu thực khác nhau. Các mẫu chúng tôi tiến hành khảo sát bao gồm: mẫu nước môi trường, mẫu gạo và mẫu ngô. Các mẫu được đồng nhất, sau đ được đem cân, thêm nội chuẩn và tiến hành phân tích nhƣ qui trình đã tối ƣu h a ở trên. Bảng 3.14 dưới đây thể hiện kết quả phân tích, cho thấy các mẫu phân tích đều không có hàm lƣợng nhóm chất diệt cỏ glyphosate, hàm lƣợng nội chuẩn dùng để kiểm soát mẫu quá trình phân tích có tính ổn định cao.
Bảng 3.14. Kết quả phân tích mẫu th c tế Nền mẫu
Tín hiệu
GLY AMPA GLU 3PA GLY IS AMPA
IS
Mẫu nước
Nước_01 KPH KPH KPH KPH 346 87
Nước_02 KPH KPH KPH KPH 382 106
Nước_03 KPH KPH KPH KPH 330 101
Nước_04 KPH KPH KPH KPH 326 102
Nước_05 KPH KPH KPH KPH 333 92
Nước_06 KPH KPH KPH KPH 360 82
Nước_07 KPH KPH KPH KPH 310 100
Mẫu gạo
Gạo_01 KPH KPH KPH KPH 116 19
Gạo_02 KPH KPH KPH KPH 121 20
Gạo_03 KPH KPH KPH KPH 124 35
Gạo_04 KPH KPH KPH KPH 95 22
Gạo_05 KPH KPH KPH KPH 90 21
Mẫu ngô
Ngô_01 KPH KPH KPH KPH 43 42
Ngô_02 KPH KPH KPH KPH 68 43
Ngô_03 KPH KPH KPH KPH 46 40
Ngô_04 KPH KPH KPH KPH 65 78
Ngô_05 KPH KPH KPH KPH 47 45
Ghi chú: KPH là không phát hiện.