3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của đàn gà, vịt sau tiêm vacxin H5N1 Navet-vifluvac
2.3.4.1. Bố trí thí nghiệm
Giám sát đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch sau tiêm phòng mũi 1: Sau khi tiêm phòng vacxin H5N1 Navet-vifluvac mũi 1 cho gà, vịt tại các huyện, thành, thị thuộc tỉnh Quảng Ninh đợt tháng 9/2019, tiến hành lựa chọn 5 hộ gia đình nuôi gà và 5 hộ gia đình nuôi vịt thuộc 5 địa phương (Hạ Long, Uông Bí, Bình Liêu, Đầm Hà và Hải Hà), tỏch riờng đàn 30 gà và 30 con vịt được tiờm phũng để theo dừi lấy mẫu giám sát sau tiêm phòng. Tiến hành lấy mẫu tại các thời điểm 30, 60, 90, 120 và 150 ngày sau tiêm phòng để xác định chỉ tiêu này.
Giám sát đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch sau tiêm phòng mũi 2 (tiến hành tương tự mũi 1): Sau khi tiêm phòng vacxin H5N1 Navet-vifluvac mũi 2 cho
gà, vịt tại các huyện, thành, thị thuộc tỉnh Quảng Ninh đợt tháng 3-4/2020, tiến hành lựa chọn 5 hộ gia đình nuôi gà và 5 hộ gia đình nuôi vịt thuộc 5 địa phương (Hạ Long, Uông Bí, Bình Liêu, Đầm Hà và Hải Hà), tách riêng đàn 30 gà và 30 con vịt được tiờm phũng để theo dừi lấy mẫu giỏm sỏt sau tiờm phũng. Tiến hành lấy mẫu tại các thời điểm 30, 60, 90, 120 và 150 ngày sau tiêm phòng để xác định chỉ tiêu này.
2.3.4.2. Giám sát huyết thanh
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của các đàn gà nuôi tại một số huyện đã được tiêm vacxin H5N1 Navet-vifluvac tại các thời điểm sau khi tiêm là 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày và 150 ngày. Đàn gà thí nghiệm là đàn gà của hộ gia đình trong tỉnh do thú y cơ sở tiêm phòng và được nuôi dưỡng, chăm sóc như các đàn gà khác trên địa bàn tỉnh.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của các đàn vịt trong tỉnh đã được tiêm vacxin H5N1 Navet-vifluvac tại các thời điểm sau khi tiêm là 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày và 150 ngày (đến khi vacxin không còn khả năng bảo hộ). Đàn vịt thí nghiệm là đàn vịt của hộ gia đình trong tỉnh do thú y cơ sở tiêm phòng và được nuôi dưỡng, chăm sóc như các đàn vịt khác trên địa bàn tỉnh.
2.3.4.3. Giám định virus phân lập bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI
Theo hướng dẫn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2005), cách tiến hành phản ứng HI như sau:
* Nguyên lý:
Virus cúm gia cầm có đặc tính gây ngưng kết hồng cầu một số loài gia súc, gia cầm. Nếu gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng thì virus bị kháng thể đặc hiệu trung hoà, không còn virus để tiếp xúc với hồng cầu hay nói cách khác kháng thể đã ngăn trở sự ngưng kết hồng cầu của virus. Còn nếu virus không gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng, virus sẽ không bị trung hoà và virus sẽ làm hồng cầu ngưng kết lại với nhau.
* Chuẩn bị kháng nguyên
- Chuẩn bị kháng nguyên: là kháng nguyên của virus cúm, loại serotyp virus cúm cần cho yêu cầu kiểm tra.
- Kháng nguyên được chuẩn độ bằng phản ứng HA.
- Pha kháng nguyên 4 HA/25μl: lấy độ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngưng kết hồng cầu chia cho 4.
Ví dụ: Hiệu giá HA của kháng nguyên (dịch niệu mô) là 1/127. Đơn vị 4 HA
= 127: 4 = 32
Như vậy sẽ trộn 1 phần kháng nguyên (nước trứng) với 31 phần PBS để đạt được dung dịch kháng nguyên 4 HA.
- Chuẩn độ kháng nguyên 4 HA: sau khi pha, kháng nguyên 4HA phải được chuẩn độ lại.
Tiến hành:
+ Cho 25μl PBS vào giếng A1 - C6.
+ Cho 25μl kháng nguyên đã pha vào các lỗ A1 đến C1.
+ Pha loãng kháng nguyên từ cột 1 đến cột 5, sau đó bỏ đi 25μl.
+ Đối chứng ở cột 6 (gồm PBS và hồng cầu).
+ Cho 25μl PBS vào các lỗ của đĩa (từ A1 - C6).
+ Cho 25μl hồng cầu gà 1% vào các lỗ của đĩa (từ A1 - C6).
+ Lắc đều ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đọc kết quả khi hồng cầu ở cột đối chứng lắng hoàn toàn.
Đọc kết quả:
+ Pha chuẩn: kết quả ngưng kết xảy ra ở 2 giếng đầu.
+ Pha không chuẩn:
Kháng nguyên đặc: nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 là thừa kháng nguyên.
Như vậy, kháng nguyên HA phải được pha loãng (có thể gấp đôi) để có ngưng kết ở giếng thứ 2.
Kháng nguyên loãng: nếu ngưng kết ở giếng thứ 1 tức là thiếu kháng nguyên, có thể thêm một lượng kháng nguyên (bằng lượng kháng nguyên pha ban đầu) để có ngưng kết ở giếng thứ 2.
* Tiến hành phản ứng HI
Dùng đĩa ngưng kết 96 lỗ chữ V. Ghi mẫu huyết thanh cần kiểm tra và subtyp virus đưa vào phản ứng lên đĩa ngưng kết.
- Cho 25μl PBS vào tất cả các lỗ trên đĩa.
- Cho 25μl huyết thanh kiểm tra vào các lỗ từ A1 - H1 (cột 1).
Pha loãng huyết thanh: pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 bằng cách lấy 25μl huyết thanh từ cột 1 chuyển sang cột 2 trộn đều với PBS của lỗ, sau đó lại chuyển 25μl từ cột 2 sang cột 3 cứ làm như vậy huyết thanh được pha loãng đến cột 11 thì hút bỏ đi 25μl huyết thanh. Cột 12 dùng làm đối chứng.
- Nhỏ 25μl kháng nguyên 4HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 đến 11.
Thêm 25μl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12).
- Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Nhỏ 25μl dung dịch hồng cầu gà (1%) vào tất cả các giếng trong đĩa, lắc đều.
Để ở nhiệt độ phòng 40 phút. Đọc kết quả.
Đọc kết quả:
Phản ứng âm tính (-): nếu không có hiện tượng ngưng kết xảy ra.
Phản ứng dương tính (+): nếu hồng cầu lắng xuống đáy giếng chữ V.
Hiệu giá HI của mẫu được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Tức là, virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn tương ứng với nhau.
Theo quy định số 1361/TY - DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và PTNT (2005), ngưỡng bảo hộ hiệu giá (HI) = 4 log2.
Kháng thể cao hiệu giá ≥ 4 log2
Không được bảo hộ hiệu giá < 4 log2
- Cách tính hiệu giá kháng thể: Hiệu giá HI của mẫu được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất vẫn còn khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu hoàn toàn. Độ pha loãng huyết thanh theo cơ số 2.
- Mẫu huyết thanh sau khi tiêm vacxin cúm gia cầm có HGKT ≥ 4log2 được coi là dương tính.