* Phương pháp định lượng glucose huyết.
X c định nồ g độ glucose huyết tr y đo đường huyết với que thử tự động One Touch Ultra.
Nguyên tắc: Bộ KIT thử dựa trên phản ứng oxy hoá glucose bằng
glucose oxidase (GOD) và hydrogen peroxide tạo thành tác dụng với 4- aminoantipyrin và phenol nhờ xúc tác của peroxidase (POD) tạo phức hợp quinoimin theo các phản ứng.
Glucose+O2 Glucose
oxidase Gluconic acid+H2O2
Peroxidase
Gluconic acid+Phenol+4-aminoantipyrin Qui oi i (đỏ)+4H2O2
Cườ g độ àu được x c đị h theo phươ g ph p đo qua g tươ g ứng với lượng glucose trong máu cầ đị h lượng.
Phương ph p tiến hành:
- Gắn một que thử rồi bật máy đo đường huyết tự động OneTouch Ultra sau đ nhấ út C đ chọn code chính xác với mã ghi trên lọ que thử.
- Lấy i chích vào đuôi chuột, vuốt nhẹ cho máu ra khoảng 1µl và giọt máu phải tr đầy. Thấm nhẹ giọt u vào đi m nhận máu trê đầu que
thử, máu tự độ g được hút vào vù g đo ơi phản ứng xảy ra. Sau 5 giây kết quả sẽ hi n thị trên màn hình máy đo đường huyết tự động One Touch Ultra.
Hình 2.8: Định lượng glucose huyết của chuột.
* Tiến hành lấy mẫu thử nghiệm sau khi kết thúc đợt thí nghiệm
Cho chuột nhị ă trước 24 giờ khi lấy mẫu. Giết chuột bằng cách cắt đầu ha h đ thu u. M u được x c định các chỉ số: Glucose, cholesterol, triglycerid, HDL-c, LDL-c. Đây là hững chỉ số đ g ti cậy đ đ h gi ảnh hưởng của cao chiết phâ đoạn từ rễ củ cây Trạch tả.
* Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh.
Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) được x c định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động. Nguyên tắc xác định của m i chỉ số như sau:
+ Định lượng cholesterol toàn phần.
Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằ g cholesterol oxydase (C O). Đo ật độ quang của quynonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxydase. Các phản ứng:
cholesterol esterase
Este hóa cholesterol + H2O Colesterol + Acid béo tự do
Cholesterol oxidase
Cholesterol + O2 3-one-cholestenon + H2O2
Peroxidase (POD)
2 H2O2+ Phenol+ 4-amino-Antipirin (AAP) Quinonimin Đo ật độ quang học quynonimin ở bước sóng 546nm (máy Olympus AU400) rồi so với chuẩ đ tính kết quả.
+ Định lượng triglycerid.
Thuỷ phân triglycerid bằ g e zy e lipase, đị h lượng glycerol giải phóng ra bằ g phươ g ph p đo àu của quynonimin tạo thành từ 4- aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:
Lipase
Triglycerid Glycerol + Acid béo
Glycerol kinase
Glycerol + ATP Glycerol-3-P
Glycerol-phosphate oxidase
Glycerol-3-P+ADP Dihydroxiaceton phosphat+ H2O2
Peroxidaza
H2O2+ 4-amino-Antipirin + 4-chloro-Phenol Quinonimin Đo ật độ quang học quynonimin ở bước sóng 546nm (máy Olympus AU400) rồi so với chuẩ đ tính kết quả.
+ Định lượng HDL-c
Nguyên tắc: Xét nghiệm gồ hai bước đặc hiệu. ước thứ nhất cholesterol trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứ g e zy e đặc hiệu. ước thứ hai cholesterol tro g DL được đị h lượng bằng phản ứng enzyme với sự có mặt của chất surfacta t đặc hiệu cho HDL.
Bƣớc 1:
CHE + CHO Điều kiện đặc biệt
Chylomicron, LDL, VLDL Cholestenon + H2O Catalase 2H2O2 2 H2O + O2 Bƣớc 2: CHE + CHO Surfactant đặc hiệu HDL Cholestenon + H2O2 Peroxidase 2.2.7. Phương pháp xử lý thống kê
Đ tiến hành thí nghiệ đạt kết quả hư ục ti u đề ra, chúng tôi hằng ngày theo dõi, ghi chép diễn biến, kết quả thí nghiệm vào sổ ghi chép cá nhân.
Chỉ số glucose huyết được so sánh giữa thời đi trước và sau nghiên cứu; so sánh giữa các lô dùng thuốc và lô đối chứng ở cùng thời đi m [21], [23].
* Tỷ lệ t ng glucose hu ết được tính theo công thức
Tỷ lệ % tă g glucose huyết:
1% B A 100
X
A
X1 – Tỷ lệ % tă g glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời đi ba đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời đi đ h gi
Sự khác biệt được ki định bằng thuật toán t- test student với p < 0,05 c ghĩa thống kê.
* Tỷ lệ hạ glucose huyết, (TC, TG, HDL-c, LDL-c ) được tính theo công thức dưới đâ Tỷ lệ % hạ glucose huyết: 2% B A 100 X A X2 – Tỷ lệ % hạ glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời đi ba đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời đi đ h gi
Sự khác biệt được ki định bằng thuật toán t- test student với p < 0,05 c ghĩa thống kê.
Các số liệu thu được được bi u diễ dưới dạng giá trị trung bình sai số (SE), các số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm Microsoft Office Excel với các phép thử t-test cho các mẫu độc lập và phân tích Anova với mức ghĩa p < 0,05 [21].
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ rễ củ cây Trạch tả (Alisma phantago-aquatica L.) phantago-aquatica L.)
Đ khảo sát thành phần hóa học của rễ củ cây Trạch tả chúng tôi thực hiện theo quy trình chiết rút được mô tả ở hình 3.1 dưới đây:
Hình 3.1. Quy trình chiết xuất các hợp chất tự nhiên từ rễ củ cây Trạch tả
Cao n – hexan 97 g
5000 g Rễ củ Trạch tả
Ngâm với ethanol 96%, lọc chiết 3 lần
Cao ethanol 298 (g) Trích lại cao ethanol 50 (g) Phần còn lại Cao CHCl3 38 g Phần còn lại Cao EtOAc 45 g Cao PĐ ước 60,8g Bổ su g ước cất + n –hexan , tỉ lệ (1:1)
Cô loại bỏ dung môi
Cô loại bỏ dung môi
Cô loại bỏ dung môi
Bổ sung CHCl3,tỉ lệ (1:1)
Từ 5000 gam rễ củ cây Trạch tả khô được ngâm kiệt 3 lần trong ethanol 96% tinh khiết ở nhiệt độ phòng, lọc chiết 3 lần liên tiếp, loại du g ôi dưới áp suất giả thu được mẫu cao cồn tổng số là 298g. Giữ lại 50g dùng cho quá tr h phâ tích và điều trị cho chuột (chiếm 16,78% tổng khối lượng cao cồn tổng số), khối lượng cao cồn còn lại (248g) dù g đ tách chiết qua các dung môi hữu cơ c độ phân cực tă g dần: n-hexan, chloroform, ethylacetate theo quy trình chiết rút trên. Cụ th là hòa tan cao cồn tổng số vào ước ấm rồi chiết, lọc 3 lần qua dung môi n-hexan tỷ lệ 1:1 theo th tích. Thu phân lớp n- hexan cô loại bỏ du g ôi được 97g cao phâ đoạn n-hexan. Phân lớp ước còn lại hòa tan với CHCl3 tỷ lệ 1:1 theo th tích(cũ g chiết, lọc 3 lần), thu phân lớp CHCl3 cô loại bỏ du g ôi thu được cao phâ đoạn CHCl3 38g . Phân lớp ước còn lại hoà tan với EtOAc tỷ lệ 1:1 theo th tích (cũ g chiết, lọc 3 lần), thu phân lớp EtOAc cô loại bỏ du g ôi được 45g cao phâ đoạn EtOAc. Phân lớp ước còn lại cô cạ được cao phâ đoạ ước 60,8g.
Từ sơ đồ quy trình tách chiết trên, chúng ta thấy được hiệu suất tách chiết c c phâ đoạn từ rễ củ cây Trạch tả hư sau:
Bảng 3.1. Hiệu suất tách chiết các phân đoạn từ rễ củ cây Trạch tả
Phân đoạn Khối lƣợng dịch chiết cô đặc (g)
Hiệu suất chiết rút (% nguyên liệu khô)
Cao ethanol 298 5,96
Cao n-hexan 97 1,94
Cao CHCl3 31 0,62
Cao EtOAc 45 0,9
Cao PĐ ước 60,8 1,22
Hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phâ đoạn cao ethanol (5,96% so với nguyên liệu hô ba đầu), tiếp đế là cao phâ đoạn n-hexan (1,94%), cao phâ đoạn chloroform thấp nhất (0,62%), cao phâ đoạn ethyl acetate là (0,9%) và cao phân đoạ ước là (1,22%). Kết quả này cho thấy trong rễ củ cây Trạch tả có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên và các cao phân đoạ thu được sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết rễ củ cây Trạch tả
3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong rễ củ cây Trạch tả
Chúng tôi tiến hành thử định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trư g. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 .Bảng kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ cây Trạch tả
Nhóm chất Thuốc thử Mẫu
EtOH n-hexan CHCl3 EtOAc PĐ nƣớc Flavonoid Shinoda +++ +++ + + + Diazo ++ ++ + + - H2SO4 đặc +++ +++ - + + Tannin Va ili / Cl (đ) + + + - - Vanilin +++ +++ + + + Gelatin/NaCl ++ + + ++ + Acetat chì +++ +++ -- + -- Polyphenol khác NaOH 10% +++ ++ -- - -- FeCl3 5% ++ ++ + + + Alkaloid Mayer + + + + - Dragendroff ++ + + + + Bouchardat + - - - - Glycoside Keller-killian +++ ++ + + +
(Ghi chú: (+): C c mức phản ứng dương tính (-): Phản ứng âm tính; Mức độ phản ứng được thể hiện bằng số dấu (+) hoặc (-) )
Kết quả đị h tí h cho thấy, thà h phầ c c hợp chất tro g rễ củ cây Trạch tả h pho g phú, c đầy đủ c c h hợp chất tự hi phổ biế hư flavo oid, ta i , glycoside. Tro g đ ở c c phâ đoạ etha ol, -hexa hầu hết c c phả ứ g với c c h chất đều dươ g tí h. Cao của cả 4 phâ đoạ EtOH, n-hexan, CHCl3 và EtOAc đều chứa c c thà h phầ ày hư g với hà lượ g h c hau. Că cứ vào ức độ phả ứ g cho thấy cao phâ đoạ EtO , -hexa phả ứ g với c c thuốc thử hậ biết flavo oid, ta i và al aloid ạ h hơ với c c phâ đoạn còn lại. Như vậy, cao phâ đoạ EtO , -hexa chứa hà lượ g c c chất tự hi lớ và pho g phú hất, tiếp đến là phâ đoạ EtOAc và C Cl3 , cuối cù g là phâ đoạ ước.
3.2.2. Phân tích thành phần hợp chất tự nhiên có trong rễ củ cây Trạch tả bằng sắc ký lớp mỏng
Chúng tôi tiến hành chạy sắc kí bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 lầ lượt với các hệ dung môi sau:
Bảng 3.3. Một số hệ dung môi tiến hành chạy sắc kí bản mỏng
STT Hệ dung môi Tỷ lệ
1 Toluen : Ethyl acetate : Acetone : Acid formic 5 : 3 : 1 : 1 2 Toluen : Ethyl acetate : Acetone : Acid formic 5 : 2 : 2 : 1
3 Cloroform : Ethyl acetate 5 : 2
4 Cloroform : Aceton 8 : 2
5 n-hexan : Aceton 5 : 2
6 Petroleum ether : Ethyl acetate 8 : 9
7 Petroleum ether : Diethyl ether 95 : 5
8 Petroleum ether : Diethyl ether : Acetic acid 1% 95 : 5 : 1% Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% - Vanilin 1% mới pha trong methanol được phu đều trên bản mỏng.
Sau đây là một số hình ảnh mà chúng tôi chạy thử ở các hệ dung môi khác nhau và các dịch chiết ở nồ g độ khác nhau trước khi quyết định lựa chọn dung môi phù hợp nhất.
(1) (2) (3)
Hình 3.2. Một số hình ảnh sắc ký đồ các phân đoạn dịch chiết chạy ở các hệ dung môi khác nhau
Trong đ :
(1) chạy qua hệ dung môi TEAF = 5:3:1:1
(2) chạy qua hệ dung môi Petroleum ether : Diethyl ether = 95: 5 với những nồ g độ khác nhau
(3) chạy qua hệ dung môi Petroleum ether : Diethyl ether : Acetic acid 1% = 95: 5 : 1%
Qua qu tr h thă d chú g tôi thấy hệ dung môi Petroleum ether: Diethyl ether: Acetic acid 1% = 95 : 5 : 1% là cho kết quả rõ nét nhất và được chúng tôi lựa chọn là dung môi phù hợp.
1 2 3 4 5
Hình 3.3. Sắc ký đồ các phân đoạn dịch chiết chạy hệ dung môi Petroleum ether : Diethyl ether : Acetic acid 1% = 95 : 5 :1%
Kết quả sắc đồ hình 3.3 cho thấy bản sắc ký xuất hiện nhiều bă g vạch có màu sắc khác nhau.
Qua quan sát trên sắc đồ, chúng tôi nhận thấy kết quả sắc đồ của c c phâ đoạn dịch chiết từ rễ củ cây Trạch tả đều cho nhiều bă g vạch với nhiều màu sắc, c c bă g vạch nằm gối lên nhau. Màu sắc c c bă g vạch gồm các màu chủ yếu hư: Màu và g (flavo oid), àu tí (tecpen), màu xanh (tanin) chứng tỏ tro g c c phâ đoạn dịch chiết từ rễ củ cây Trạch tả chứa thành phần các hợp chất tự nhiên khá phong phú. Đây là cơ sở bước đầu cho phép chúng ta tiếp tục khảo sát các tác dụng của các hoạt chất có trong rễ củ cây Trạch tả lên trọ g lượng, nồng độ đường huyết và chỉ số lipid trên chuột béo ph và ĐTĐ. Chú thích: 1: Cao EtOH 2: Cao EtOAc 3: Cao CHCl3 4: Cao n-hexan 5: Cao PĐ ước
3.3. Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin-Ciocalteau
Đường chuẩn gallic acid được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch gallic acidở các nồ g độ 0; 50; 100; 250; 500; 1000mg/l, tiến hành so màu trên máy quang phổ UV - VIS 1000 ở bước s g λ=760 . Kết quả được th hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn gallic acid
STT Gallic acid(mg/l) OD 760nm 1 0 0,031 2 50 0,069 3 100 0,101 4 250 0,238 5 500 0,506 6 1000 1,073
Từ số liệu bảng 3.4 ứng dụng phần mềm Microsoft Excel ta vẽ được đồ thị đường chuẩn gallic acid hư h h 3.4 dưới đây:
Hình 3.4: Đồ thị đường chuẩn gallic acid
1000 mmol/l tỉ lệ thuận với OD do đ du g dịch mẫu đ x c định phải nằm trong khoảng này.
Đị h lượng polyphenol của dịch chiết c c phâ đoạn bằ g phươ g pháp Folin-Ciocalteau. Dịch chiết mẫu cho phản ứng với thuốc thử Folin- Ciacalteau tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV - VIS 1000 ở bước s g λ = 760nm, dùng chất chuẩn là gallic acid đ tính lượng polyphenol. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả định lƣợng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ cây Trạch tả
Mẫu OD760nm Hàm lƣợng polyphenol (mg/l) Tỷ lệ (%) Cao EtOH 0,442 408 4,08 Cao n-hexan 0,396 362 3,62 Cao CHCl3 0,257 223 2,23 Cao EtOAc 0,310 276 2,76 Cao PĐ ước 0,102 68 0,68
Qua bảng 3.5 ta thấy hà lượng polyphenol tổng số trong cao EtOH là cao nhất (408 mg/l), thấp nhất là cao phâ đoạ ước (68 mg/l), các cao phâ đoạn n-hexan, CHCl3, EtOAc lầ lượt là 362 mg/l; 223 mg/l; 276 mg/l.
3.4. Kết quả xác định liều độc cấp
X c định LD50 của dịch chiết tổng số từ rễ củ cây Trạch tả trên chuột nhắt trắng bằ g đường uố g theo phươ g ph p của Lorke. Chuột cho nhịn đ i trước 16 giờ thí nghiệ , được phân lô ngẫu nhiên, m i lô 5 co và được cho uống theo liều tă g dần từ 5000 mg/kg đến 8000 mg/kg th trọng. Theo dõi bi u hiện và số chuột chết trong 72 giờ đ đ h gi ức độ độc của dịch chiết từ rễ củ cây Trạch tả.
Bảng 3.6. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%