Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng thuần chủng dòng Swiss, trưởng thành, khỏe mạ h được cân từ g co , đ h dấu, phân lô ngẫu nhiên trước khi thí nghiệm. Chuột được chia làm 8 lô, m i lô gồm 5 con.
* Tạo mô hình chuột béo phì
- Nhóm uôi thường (lô 1): Cho ă chế độ b h thường (thức ă chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW).
- Nhóm nuôi béo (lô 2 đến lô 8): Cho ă thức ă giàu lipid với thành phầ được trộn từ nhiều loại thức ă h c hau hư: gô, sữa bột, đậu tươ g, l g đỏ trứng, lạc, mỡ ước…
- Thời gian nuôi chuột theo 2 chế độ ă là 6 tuần.
Thành phần thức ă được tính toán dựa trên thành phầ dưỡng chất của từng loại h n hợp thức ă phối trộn, theo tài liệu chuẩn của Việ di h dưỡng Quốc gia Việt Nam.
Bảng 2.1. Thành phần thức ăn giàu lipid
Thành phần Tỉ lệ % Hydratcacbon 41 Lipid 32 Protein 20 Cholesterol 1 Chất khoáng 4
Vitamin & acid amin 2
Sau 6 tuần nuôi, tiến hành cân trọ g lượng và xét nghiệm một số chỉ số ho si h hư: glucose u, lipid u gồm cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c đ x c định mức độ khác nhau của các lô theo hai chế độ ă .
Hình 2.6: Chuột bình thường và chuột béo phì
* Phương pháp gây ĐTĐ type 2 từ chuột béo phì thực nghiệm bằng Streptozotocin (STZ) liều thấp.
Streptozotocin (STZ: 2 - deoxy - 2 - (3 - metyl - 3 - nitrosoureido) - D - glucopyranose) là chất có hoạt tính chố g u g thư được chiết xuất từ nấm Streptomyces achromogens. Khả ă g gây ĐTĐ của STZ đã được phát hiện vào ă 1963. K từ đ STZ được sử dụng rộ g rãi tro g ô h h động vật ĐTĐ type 1 và type 2 phục vụ trong các nghiên cứu về thuốc.
Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiế hà h gười ta có th gây ĐTĐ type 1 hay type 2.
ĐTĐ type 1: với chuột cố g trưởng thành, tiêm liều duy nhất từ 40 - 60 mg/kg th trọng hoặc cao hơ . Với chuột nhắt trưởng thành, tiêm liều 100 – 150 mg/kg th trọng.
ĐTĐ type 2: Với chuột cống, tiêm STZ liều 100 g/ g vào gày đầu tiên sau khi sinh. Với chuột nhắt, có th nuôi béo phì (6- 8 tuần) sau đ ti STZ với liều đơ 100 – 110 mg/kg pha tro g đệm citrate 0,01M; pH = 4,5).
STZ được nhận biết và xâm nhập vào tế bào β qua h vận chuy n glucose. Hoạt động của nó trong tế bào làm tổ thươ g và al yl h a ADN và cuối cùng dẫn tới hoại tử tế bào. Hoạt tính alkyl hóa của STZ do hoạt động của nhóm nitrosourea của n , đặc biệt là ở vị trí O6 của guanine.
STZ tạo ra nitric oxide (NO) làm tổ thươ g ADN của tế bào β. Mặt khác, hoạt động của NO làm ức chế chu trình Krebs, giảm tiêu thụ oxy trong ty th từ đ là giảm mạnh sự sản xuất ATP và tổn hại đến các nucleotit của tế bào. Đồng thời phân tử này còn ức chế hoạt tính enzyme aconitase. Mặt khác, sự tă g cường loại bỏ gốc phosphate của ATP sẽ bổ su g cơ chất cho xa thi e oxidase và tă g cường sản xuất acid uric. Sau đ , xa thi e oxidase xúc tác phản ứng tạo thành anion superoxyde (O2
-
). Cuối cùng anion superoxyde sinh ra hydrogen peroxide (H2O2) và gốc hydroxyl (OH-). Các dạng oxy phản ứ g ày cũ g tập trung phá hủy ADN và gây ra những thay đổi bất lợi cho tế bào. NO và các dạng oxy hoạt động còn có th tạo thành peroxy itrate (ONOO) c độc tính cao. Tổ thươ g ADN gây ra bởi STZ làm tă g cường quá trình trùng hợp ADP (Poly ADP - ribosylation) dẫ đến làm mất NAD+, xa hơ ph hủy ATP dự trữ và sau đ ức chế sự tổng hợp và tiết insulin của tế bào β ở đảo Langerhan.
Ngoài ra ở chuột béo phì có nồ g độ acid béo cao và triglycerid cao gây hiệ tượ g “nhiễm độc mỡ”. Chính acid béo là thủ phạm của quá trình peroxit hóa, tạo gốc tự do gây độc nhiều cơ qua là tho i ho chức ă g của thụ th insulin và khả ă g tổng hợp insulin từ đ sẽ dẫ đế đối kháng i suli và gây ĐTĐ type 2.
Sau khi chuột được nuôi béo phì thực nghiệm thành công chúng tôi tiếp tục tiế hà h gây ĐTĐ type 2 bằng cách tiêm liều đơ STZ (110 mg/kg th trọng pha tro g đệm citrate 0,01M; pH = 4,5).
Hình 2.7: Thuốc STZ và cách tiêm dưới màng bụng
Trước khi thí nghiệm đo đường huyết rồi cho chuột nhị đ i 16h, ti màng bụng STZ gây rối loạ trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm nhằm tạo ô h h ĐTĐ type 2 phát tri n từ béo phì. Sau 72h đo đường huyết, chuột ào c đường huyết cao (≥18 ol/l) và ổ đị h được lựa chọ đ phân lô cho uống cao c c phâ đoạn dịch chiết trong vòng 21 gày. Đường huyết tro g c c trường hợp tr đều được đo sau hi cho chuột nhị qua đ (12 giờ), chỉ cho uố g ước.
* Phân lô chuột thí nghiệm
Sau hi đã tạo được chuột béo phì và chuột ĐTĐ type 2 chúng tôi tiến hành phân lô chuột thí nghiệ hư sau:
Lô 1: Chuột b h thường (lô đối chứng âm)
Lô 2: Chuột béo phì-ĐTĐ, hô g điều trị (lô đối chứ g dươ g) Lô 3: Chuột béo phì-ĐTĐ, điều trị cao phâ đoạn EtOH
Lô 4: Chuột béo phì-ĐTĐ, điều trị cao phâ đoạn n- hexan Lô 5: Chuột béo phì-ĐTĐ, điều trị cao phâ đoạn CHCl3 Lô 6: Chuột béo phì-ĐTĐ, điều trị cao phâ đoạn EtOAc Lô 7: Chuột béo phì-ĐTĐ, điều trị cao phâ ước
Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 co /lô) được ă thức ă thườ g và điều trị hằng ngày bằng cách cho uố g cao c c phâ đoạn dịch chiết hư bảng 2.2. Đường huyết của các con chuột được đo vào cù g ột thời đi m trong ngày và sau khi nhị đ i 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước hi điều trị), ngày thứ 7, thứ 14, thứ 21 khi điều trị. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.2. Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ cây Trạch tả
Lô Chế độ ăn
trƣớc điều trị Tiêm
Chế độ ăn khi
điều trị Mục đích
1 Thức ă chuẩn Thức ă chuẩn Uố g ước cất, hô g điều trị.
2 Thức ă béo STZ Thức ă chuẩn Uố g ước cất, hô g điều trị.
3 Thức ă béo STZ Thức ă chuẩn Điều trị cao phâ đoạn EtOH (2000mg/kg).
4 Thức ă béo STZ Thức ă chuẩn Điều trị cao phâ đoạn n- hexan (2000mg/kg).
5 Thức ă béo STZ Thức ă chuẩn Điều trị cao phân đoạn CHCl3
(2000mg/kg).
6 Thức ă béo STZ Thức ă chuẩn Điều trị cao phân đoạn EtOAc (2000mg/kg).
7 Thức ă béo STZ Thức ă chuẩn Điều trị cao phâ đoạ ước (2000mg/kg).
8 Thức ă béo STZ Thức ă chuẩn Điều trị metformin