Sau đ , thu dịch chiết lọc qua giấy lọc và cất loại du g ôi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cao etha ol. Cao etha ol được h a ta tro g ước nóng và chiết lầ lượt với các dung môi n-hexan, clorofor , ethyl acetate thu được các dịch chiết, sau đ cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cao chiết tươ g ứng.
2.2.2. Khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong rễ củ cây Trạch tả tả
2.2.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên
* Định tính flavonoid
Dung dịch thử: Mẫu thử được pha trong ethanol (96%) với một lượng thích hợp.
- Phản ứng Shinoda: Cho thêm vài giọt HCl vào dung dịch mẫu. Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ố g đối chứng, ống kia thêm vài mảnh Mg và đu tr ồi cách thủy trong vài phút. Phản ứ g dươ g tí h hi tro g ống nghiệm xuất hiện màu hồ g, đỏ hay da cam.
- Phản ứng diazo hóa: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiêm: Một ống đối chứng, ống kia nhỏ thêm vài giọt thuốc thử diazo. Phản ứng cho kết quả dươ g tí h hi tro g ống nghiệm xuất hiện màu da cam.
- Phản ứng với acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: Một ố g đối chứng, ống kia thêm vài giọt H2SO4 đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavo và flavo ol, àu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
* Định tính tannin
- Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: Một ố g đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dươ g tí h hi thu được àu đỏ đậm.
- Phản ứng với gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứ g dươ g tí h hi tro g du g dịch xuất hiện vẩ đục.
- Phản ứng với acetate chì: Cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung dịch mẫu, phản ứ g dươ g tí h hi xuất hiện kết tủa.
* Định tính các polyphenol khác
- Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử được pha hư tr . Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: Một ố g đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứ g dươ g tí h hi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
- Phản ứng với FeCl3: Nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5N vào ống nghiệ đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dươ g tí h hi du g dịch có màu lục, tía, la , xa h đe hay đe .
* Định tính alkaloid
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp đ làm các phản ứng.
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (h n hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): phản ứng cho kết tủa màu nâu sẫm.
- Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (h n hợp HgCl2 và KI trong ước): phản ứng cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (h n hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acid acetic): phản ứ g cho àu và g da ca đế đỏ.
* Định tính glycoside:
Phản ứng Keller-Killian: - Thuốc thử Keller-Killian:
Dung dịch A: Thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50 ml acid acetic 10%. Dung dịch B: Thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50 l acid su furic đặc. - Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứ g dươ g tí h khi xuất hiệ v g âu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
2.2.2.2. Phương ph p sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC - thi layer chro atography) là ĩ thuật sắc ký khá nhanh gọn và tiện lợi. Nó giúp nhận biết các nhóm chất có trong mẫu nghiên cứu. Phươ g ph p sắc ký lớp mỏng, thành phần trong h n hợp được x c định nhờ so sánh hệ số lưu của h n hợp (Rf)và hệ số lưucủa một số chất đã biết.
Nguyên tắc: Kĩ thuật này dựa vào mức độ tươ g t c của các chất khác nhau với pha tĩ h (bản mỏ g) và pha động (hệ dung môi chạy sắc ký). Pha tĩ h c th là silicagel. Pha động là một h n hợp từ hai dung môi trở lên với c c độ phân cực khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích.
Phƣơng pháp: Các mẫu pha trong ethanol 96% ở nồ g độ thích hợp được tiến hành chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merc 1,05715) ích thước phù hợp trên các hệ du g ôi h c hau đ lựa chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất. Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% - Vanilin 1% pha trong methanol được phu đều trên bản mỏng.