Glutaraldehyde CH2(CH2CHO)2, là hợp chất chứa hai nhóm chức CHO được viết ở dạng tường minh hơn là CHO – CH2 – CH2 – CH2 – CHO. Chip đã gắn Cysteamine được ngâm trong dung dịch GAD 2% với dung môi là nước trong 2 giờ tại nhiệt độ phòng. Nhóm amin NH2 của phân tử Cysteamine sẽ liên kết với một nhóm chức CHO của phân tử GAD, nhóm CHO còn lại nằm ở phía trên tự do. Dưới đây là hình minh họa:
Hình 3.2. Cantilever khi đã gắn phân tử GAD lên lớp phân tử Cysteamine.
Chip sau khi đã gắn được phân tử GAD sẽ được ngâm trong nước DI trong 5 phút, làm khô bằng khí nito để chuẩn bị cho quá trình gắn DNA receptor.
3.3. Cố định đơn chuỗi DNA (DNA receptor) lên phân tử GAD
Đơn chuỗi DNA receptor với thứ tự TG AAC CGG AGT CCC ATC được pha thành dung dịch 10 µM trong dung dịch PBS (pH = 7.5). Chip được ngâm trong dung dịch DNA receptor trong 20 h tại 4 độ C. Nhóm CHO của phân tử GAD sẽ liên kết với nhóm amin NH2 của phân tử đơn chuỗi DNA receptor. Minh họa gắn kết DNA receptor lên phân tử GAD được minh họa dưới đây:
Hình 3.3. Cantilever khi đã cố định DNA receptor.
Trước khi thực hiện lai hóa cặp DNA, chip sau khi đã cố định DNA receptor được ngâm trong dung dịch NaBH4 để bất hoạt các nhóm chức (-CHO) không tạo liên kết với DNA receptor. Sau khi bất hoạt nhóm chức, chip được ngâm trong dung dịch PBS trong 5 phút để loại bỏ các liên kết yếu, ngâm lại trong nước DI trong 5 phút để chuẩn bị quá trình lai hóa DNA.
3.4. Lai hóa DNA đích (DNA target) vào đơn chuỗi DNA
DNA target với chuỗi thứ tự GAT GGG ACT CCG được chuẩn bị sẵn với các nồng độ 10, 5, 1, 0.1, 0.01, 0.001 µM trong dung dịch PBS (pH = 7.5). Các chip đã cố định DNA receptor lần được được cho vào dung dịch chứa DNA target chứa các nồng độ trên để thực hiện quá trình lai hóa. Quá trình lai hóa sẽ được thực hiện trong 1 giờ tại nhiệt độ phòng. Hai chuỗi DNA sẽ tự bắt cặp với nhau theo trình tự theo nguyên tắc A bắt cặp với T bằng 2 liên kết hydro, G bắt cặp với C bằng 3 liên kết hydro. Dưới đây là mô hình lai hóa của các phân tử DNA.
Hình 3.4. Cantilever khi đã lai hóa DNA target.
Toàn bộ quá trình biến đổi bề mặt để thực hiện lai hóa DNA được minh họa ở sơ đồ dưới đây:
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong chương này chúng tôi sẽ trình bày các kết quả thu được trong quá trình thực hiện luận văn này. Trước hết các kết quả chế tạo thanh dao động sẽ được trình bày, tiếp theo là các kết quả trong việc sử dụng thanh dao động chế tạo ra để phát hiện gen biến đổi DNA P53 chỉ thị của bệnh ung thư gan.
4.1. Kết quả chế tạo thanh dao động SiN 4.1.1. Hình ảnh của chip cantilever đã chế tạo 4.1.1. Hình ảnh của chip cantilever đã chế tạo
Sau khi ăn mòn lớp SiN mặt trên chúng tôi có được hình dạng của thanh dao động như trong hình 4.1. Hình này được chụp bằng kính hiển vi quang học kim loại. Quan sát ta thấy rằng, phần diện tích thanh dao động và bề mặt chip là lớp Photoresist có màu vàng nhạt phủ lên lớp SiN, vùng SiN bị ăn mòn đi để lộ ra lớp tiếp theo là SiO2 có màu xanh nước biển nhạt. Cấu trúc của các thanh được định dạng rõ và và đều. Ở hình 4.2 là hình của toàn bộ wafer sau khi ăn mòn SiN mặt trên. Ở hình chụp này ta không thể nhìn được các cantilever nằm trên chip nhưng lại cho ta nhìn cái tổng thể toàn bộ chip được sắp xếp, định dạng như thế nào trên cả wafer.
Hình 4.1. Ảnh chụp wafer sau khi đã ăn mòn lớp SiN mặt trên, hình ảnh của các thanh dao động đã hiện lên.
Hình 4.2. Ảnh chụp toàn bộ wafer sau khi đã đã ăn mòn lớp SiN mặt trên.
Sau khi ăn mòn để định hình thanh dao động ở mặt trên, tiếp theo sẽ thực hiện ăn mòn ở mặt dưới. Trước hết là ăn mòn lớp SiN. Hình 4.3 chỉ ra ảnh mặt dưới wafer sau khi lớp SiN bị ăn mòn.
Hình 4.3. Ảnh mặt sau wafer sau khi đã ăn mòn lớp SiN. Phần trắng sáng là lớp mặt nạ Al, phần tối là lớp SiO2 hiện ra - vùng cần được ăn mòn.Hình a, phần mặt dưới chip cần được ăn mòn để tạo hình cantilever; hình b, thiết kế đường
viền được ăn mòn để có thể dễ dàng tách chip.
Hình 4.4. Ảnh chụp toàn bộ mặt dưới wafer sau khi đã ăn mòn hết lớp SiN.
Qua ảnh chụp trên chip ta thấy rằng, phần không bị ăn mòn là lớp mặt nạ Al màu trắng sáng còn vùng bị ăn mòn để lộ ra lớp SiO2 tiếp theo có màu đen. Hình 4.3a là ảnh chụp phần trên của chip, nơi cần được ăn mòn để tạo ra cấu trúc của cantilever. Hình 4.3b là ảnh chụp phần dưới của chip, đường viền bao quanh màu đen là rãnh cần được ăn mòn để sau này có thể tách chip dễ dàng, có hai đường trắng nhỏ ở phía dưới là phần giữ chip nằm trên wafer sau khi đã ăn mòn xuyên wafer.
Hình 4.4 cho ta cái nhìn toàn diện hơn về toàn bộ mặt dưới của wafer sau khi đã ăn mòn lớp SiN mặt sau. Cũng giống như phân tích ở hình trên, hình 4.4 chỉ ra phần màu tối là phần SiO2 lộ ra sau khi ăn mòn hết SiN, phần trắng sáng là phần mặt nạ Al không bị ăn mòn. Để ý kĩ ta cũng thấy rằng 2 dấu so mask nằm ở hai bên của wafer cũng được nhìn thấy rõ. Chú ý rằng ở viền ngoài của wafer có màu vàng nhạt, đây thực chất là lớp Photoresist mỏng phủ trên lớp Al. Khu vực viền ngoài này được dính băng keo nên không bị ăn mòn do vậy lớp photoresist vẫn được giữ lại.
Sau cùng là hình ảnh của chip sau khi đã ăn mòn xuyên qua wafer. Ở đây chúng tôi sử dụng 2 loại wafer . Loại wafer với lớp SiN dày 1000 nm như đã trình bày ở trên và loại wafer với lớp SiN dày chỉ là100 nm. Dưới đây là hình ảnh chip chứa các cantilever với lớp SiN có độ dày 100 nm.
Hình 4.5. Ảnh chụp chip chứa 9 cantilever, chế tạo từ lớp SiN có độ dày 100 nm, trong đó Hình 4.5.a được chụp từ mặt dưới chip và Hình 4.5 b chụp từ mặt trên
chip.
Hình 4.5a và 4.5b cho ta hình ảnh của một chip còn nguyên vẹn có chứa 9 cantilever như đã thiết kế. Hình 4.5a là ảnh chụp từ mặt dưới của chip cho thấy các dãy cantilever được chế tạo ra có định dạng và kích thước giống như thiết kế, tuy nhiên ở phần chân của các cantilever gắn với thân chip việc ăn mòn chưa hoàn toàn và không được thẳng. Chúng ta cũng thấy rằng vẫn còn nhiều gợn và mấp mô ở phần tiếp xúc của thanh dao động và đế mang Si, nguyên nhân là do quá trình ăn mòn qua đế Si chưa được thực hiện hoàn toàn. Bên trong thân chip lộ ra lớp Si ăn mòn không đều, bề mặt khá ghồ ghề.
a
Hình 4.5b là ảnh chip cantilever được chụp từ mặt trên. Ta thấy rằng các thanh cantilever trên một chip rất đều nhau, có định dạng và kích thước giống như thiết kế
Tuy nhiên ở đây phải nêu rõ là loại wafer với lớp SiN dày 100 nm này chỉ dùng để chế tạo với mục đích thử nghiệm chứ nó không phù hợp cho việc chế tạo loại thanh cantilever có độ dài 500 µm. Thực tế cho thấy với thiết kế thanh dài 500 µm thì với lớp SiN chỉ dày 100 nm làm cho cantilever chế tạo ra yếu, rất dễ gẫy và vỡ. Đặc biệt các thanh loại này gãy và vỡ với tỉ lệ cao trong quá trình tách chip từ cả wafer. Theo như tính toán và kinh nghiệm của chúng tôi, với loại wafer có lớp SiN mỏng như thế chỉ thích hợp cho việc chế tạo SiN Cantilever với chiều dài trên dưới 100 µm.
Các kết quả quan sát cho thấy wafer thứ hai với lớp SiN dày 1000 nm là thích hợp cho việc chế tạo cantilever dài 500 µm như được thiết kế. Dưới đây là hình ảnh của các chip chứa các thanh dao động SiN có độ dày 1000 nm.
Hình 4.6. Chụp trên nguyên wafer, chip chưa được tách ra, SiN Cantilever dày 1 µm, rộng 100 µm dài 500 µm, khoảng cách giữa cách thanh 100 µm.
Hình 4.7. Chip SiN Cantilever đã được tách ra từ wafer. a) Các thanh dao động bị gẫy trong quá trình tách chip, do đó chip chỉ còn 3 cantilever, b) Chip giữ
được đầy đủ (9 cantilever) sau khi tách khỏi wafer.
Hình 4.6 a,b,c,d là ảnh chụp các chip cantilever khi chưa tách chip. Qua các hình ta thấy rằng các thanh lộ ra rất rõ, đều và đẹp. Các cantilever là SiN nên có màu vàng. Đa số chip giữ được nguyên vẹn 9 thanh như thiết kế (4.6a và 4.6b), còn lại một số chip (4.6c và 4.6d) có các thanh bị gẫy nên không còn nguyên vẹn. Việc gẫy các cantilever có thể là gẫy trong quá trình chế tạo hoặc có thể gẫy trong quá trình làm sạch sau khi chế tạo. Hình 4.6a và 4.6d cho thấy cấu trúc của chip rất đều, tại vị trí chân của cantilever, phần thân chip được ăn mòn khá đều và thẳng trong khi đó ở hình b và c chỉ ra tại vị trí chân của cantilever, phần thân của chip ăn mòn không đều và hơi nham nhở. Tuy thế việc ăn mòn không được thẳng này không gây ảnh hưởng nhiều đến chất lượng của cantilever. Việc quan trọng nhất của quá trình chế tạo là tạo ra các dãy cantilever thẳng đều như thiết kế ở bộ mask đã làm được.
Hình 4.7 là hình chụp 2 chip cantilever đã được tách ra từ wafer. Cũng như đã nhìn thấy khi chụp trên wafer chưa tách chip, các thanh cantilever ở cả hai chip rất đều nhau. Tại phần chân của cantilever, phần thân chip được ăn mòn thẳng và đều. Phần dưới cùng của chip là lớp SiN do không bị ăn mòn nên bề mặt phẳng như khi phủ lớp màng SiN ban đầu.
4.1.2. Tần số và chỉ số chất lương (quality factor-QF) của thanh dao động đã chế tạo đã chế tạo
Dưới đây là phổ tần số và chỉ số chất lượng QF của các SiN Cantilever đã chế tạo.
Hình 4.8. Phổ tần số của 8 Cantilever trên cùng một chip,
Hình 4.10. Phổ tần số và QF của một chip chứa 2 Cantilever, với Qmax = 29.
Các hình 4.8, 4.9 và 4.10 chỉ ra phổ tần số của một số chip cantilever. Phần lớn các cantilever có tần số dao động trong khoảng 3000 Hz. Giá trị tần số 3000 Hz khá gần với giá trị tần số mà chúng tôi tính toán lý thuyết cho cấu trúc cantilever đã chế tạo. Đo chỉ số QF (quality factor) cho thấy các cantilever có QF thay đổi trong khoảng khá rộng từ 12-29. Tuy thế trên cùng một chip thì QF là
gần như nhau. Kết quả này cho thấy qui trình chế tạo thanh dao động cần tiếp tục được nghiên cứu và hoàn thiện, để nâng cao độ đồng đều về chất lượng của các thanh dao động chế tạo từ cùng một wafer. Nếu không sau này sẽ rất khó khăn cho việc sử dụng nhiều chip vào phân tích các chất sinh học vì khi đó các kết quả phân tích sẽ rất khác nhau.
Qua khảo sát cũng cho thấy nhiều thanh dao động có chỉ số Q lớn hơn 20. Đặc biệt, ở hình 4.10 cho ta thấy tần số của 2 thanh vào khoảng hơn 3600 Hz và chỉ số Q là 25 và 29. Giá trị Q này cho thấy cantilever chế tạo ra có chất lượng tốt, rất phù hợp cho việc ứng dụng trong phát hiện các chất sinh- hóa học sau này
4.2. Kết quả thực nghiệm sử dụng chip Si Cantilever phát hiện DNA 4.2.1. Tần số và QF của chip Si cantilever
Hình 4.11 và 4.12 là phổ tần số của 10 chip, mỗi một chip chứa 9 cantilever, phổ tần số của từng cantilever không vẽ riêng mà thể hiện trên cùng 1 chip nên các phổ lồng vào nhau.
Hình 4.12. Phổ tần số của các chip 5 – 10.
Từ các phổ tần số trên ta thấy rằng, tần số của các thanh dao động vào khoảng [3700 – 4100] Hz, thống kê chỉ ra tần số trung bình của 80 thanh dao động là 3810 Hz.
Đo độ rộng bán phổ (full width at half maximum - FWHM) của của các thanh dao động cho phép xác định được chỉ số chất lượng (quality factor) của các thanh dao động trong khoảng từ 8.5 – 10.8. Dưới đây là một ví dụ xác định chỉ số chất lượng của thanh:
Hình 4.13. Phổ tần số của một thanh dao động và cách xác định chỉ số Q.
Q = 𝑓
𝐹𝑊𝐻𝑀, ở đây f là tần số dao động của thanh, FWHM (full width half maximum) là độ rộng bán phổ.
Với phổ tần số ở hình 4.13 trên ta xác định được, f = 3807 Hz, FWHM = 392 Hz nên Q = 3807/392 = 9.7.
4.2.2. Độ dịch chuyển tần số trước và sau khi gắn kết Cysteamine lên thanh dao động
Lớp tự lắp ghép phân tử Cysteamine được hình thành trên lớp vàng của thanh dao động thông qua liên kết hóa học giữa lớp Au và nhóm chức thiol (-SH). Hình 4.14 chỉ ra phổ tần số cộng hưởng của một thanh dao động điển hình trước và sau khi gắn Cysteamine. Phổ tần số trước khi gắn Cysteamine vào khoảng 3806 Hz, sau khi gắn Cysteamine tần số của thanh vào khoảng 4216 Hz. Sự tăng tần số cộng hưởng của thanh dao động sau khi hấp phụ thêm khối lượng là trái với lý thuyết vì như công thức (1.23) đã chỉ ra, khi thanh dao động hấp phụ thêm khối lượng vào thanh thì tần số của nó phải giảm đi. Sự nghịch lý này được giải thích là do ứng suất bề mặt giữa lớp Cysteamine với lớp vàng.
Hình 4.14. Phổ tần số cộng hưởng của một thanh dao động điển hình trước và sau khi gắn kết Cysteamine.
4.2.3. Độ lệch của thanh dao động trước và sau khi gắn kết Cysteamine và ứng suất của đơn lớp Cysteamine ứng suất của đơn lớp Cysteamine
Độ lệch của cantilever được đo trong không khí, tại nhiệt độ phòng (250 C)
và độ ẩm tương đối là 60%. Theo N.F. Martinez, độ ẩm tương đối không gây ra ảnh hưởng đáng kể nào đối với độ lệch của cantilever [33].
Hình 4.15 là độ lệch của microcantilever trước và sau khi gắn kết Cysteamine. Từ 2 đồ thị chúng ta thấy rằng sự thay đổi độ lệch cantilever là giống nhau (cùng tăng hoặc cùng giảm). Trước khi gắn Cysteamine, độ lệch trung bình của các cantilever là 6 ±0.754 µm với hệ số biến thiên là 12.4%. Hệ số biến thiên nhỏ chỉ ra rằng các microcantilever đã chế tạo khá đồng đều. Sau khi gắn Cysteamine, độ lệch trung bình của các microcantilever là 4.95 ± 0.7 µm, độ biến thiên là 14%. Giá trị độ biến thiên này gần với giá trị độ biến thiên trước khi gắn kết Cysteamine chỉ ra rằng lớp Cysteamine gắn lên lớp Au kết khá đồng đều trên toàn bộ mặt trên của thanh dao động.
Độ dịch chuyển trung bình độ lệch của microcantilever trước và sau khi gắn Cysteamine là 1.131 µm. Sự giảm độ lệch sau khi gắn kết Cysteamine là do ảnh hưởng của ứng suất bề mặt của lớp đơn phân tử Cysteamine tới lớp Au. Đơn lớp phân tử Cysteamine ảnh hưởng tới độ biến dạng của thanh, nó tạo ra ứng suất nén làm cho các microcantilever uốn xuống phần silic.
Những thay đổi về độ cong gây ra bởi hấp phụ phân tử được thể hiện bằng biểu thức [33]: ∆𝐾 = 6 1+2ℎ𝑓 ℎ𝑠(1−2 𝐸𝑓 𝐸𝑠 1−𝜐𝑠 1−𝜐𝑓) 𝐸𝑠 1−𝜐𝑠ℎ𝑠 2 𝑆 (4.1)
Phương trình (4.1) là phương trình Stoney sửa đổi giải thích cho sự thay đổi độ cong và dịch chuyển quanh vị trí cân bằng đối với thanh dao động có 2 lớp