II Phương pháp nghiên cứu
NY7 NY8 RBBR
50 ppm 100 ppm 200 ppm 300 ppm 400 ppm 0 ppm
NY7 NY8 RBBR
IN13 IN22
Hình 3.23 Khả năng loại màu màu thuốc nhuộm của chủng FBH11 sau 6 ngày ni
Kết quả trình bày ở hình 3.24 cho thấy enzyme MnP được sinh tổng hợp ngay ở những ngày đầu tiên đối với tất cả các màu và hoạt tính giảm dần trong những ngày tiếp theo. Đối với màu NY7 hoạt tính sinh ra bởi FBH11 cao nhất sau 2 ngày (74,4 U/l) và sau 7 ngày ni cấy hoạt tính giảm còn rất thấp (4,0 U/l). Đối với các màu NY1, NY8, NY5, RBBR hoạt tính enzyme MnP giảm khơng đáng kể. Hiện tượng này có thể dự đốn có thể có sự tham gia của enzyme ngoại bào MnP trong quá trình loại màu màu. Để làm rõ vấn đề này cần phải có những nghiên cứu tiếp theo về đặc tính của enzyme MnP sinh tổng hợp từ chủng FBH11.
22.4 4.0 41.8 29.9 14.9 4.5 10.3 35.4 74.7 70.4 45.5 24.6 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0
1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (ngày)
H o ạ t tí n h M n P U /l NY1 NY3 NY5 NY7 NY8 IN13 IN22 RBBR
Hình 3.24 Hoạt tính MnP của chủng FBH11 trên môi trường nuôi cấy chứa các màu theo thời gian
Hiện nay có ít cơng bố về khả năng sinh MnP trong quá trình loại màu thuốc nhuộm của nấm sợi. Chủng Aspergillus ochraceus NCIM-1146 ngoài khả năng sinh laccase, chủng nấm này chỉ sinh LiP, tyrosinaza trong quá trình loại màu reactive blue- 25 [55]. Chủng Pinicillium ochorochloron MTCC 517 trong quá trình phân hủy màu sinh học màu xanh triphenylmethan ngoài sinh LiP lồi nấm này cịn sinh laccase, tyrosinaza, aminopyrine, N-demethylaza, NADH-DCIP reductaza, MG reductaza trong nội bào, mà không thấy sự xuất hiện của enzyme ngoại bào MnP [65]. Tuy nhiên, chủng Aspergillus alliaceus 121C trong quá trình loại màu indigo và congo đỏ
MnP có hoạt tính thấp chỉ đạt 10,5 U/l đã xuất hiện [40].
Chủng FBH11 đã loại được màu NY1, NY7, NY8, IN13 và IN22 thuộc nhóm màu azo và màu NY3, NY5 thuộc nhóm màu anthraquinone. Đây là 2 nhóm màu rất khó phân hủy trong cơng nghệ sản xuất giấy (nhóm màu azo) và cơng nghệ dệt nhuộm (nhóm màu anthraquinone).
III.6.2 Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng dịch enzyme MnP thô
Nghiên cứu và đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của dịch MnP thô tạo ra bởi chủng FBH11 trong bioreactor thể tích 15 lít. Dịch lên men đã được lọc tách sinh khối, ly tâm thu dịch enzyme thô. Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi enzyme thô và đồng thời xác định hoạt tính theo thời gian thí nghiệm. Nồng độ của tất cả màu sử dụng trong nghiên cứu này là 100 mg/l. Với hoạt tính MnP ban đầu 140 U/l, tất cả các bình chiều chỉnh về pH 4, lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự giảm màu theo thời gian bằng phương pháp đo quang tại λmax của mỗi loại màu.
NY1 NY5
Hình 3.25 Khả năng phân hủy màu thuốc nhuộm của MnP thô từ chủng FBH11
Kết quả cho thấy khả năng loại màu của dịch enzyme thô MnP sinh ra từ
chủng FBH11 thấp hơn khi nuôi cấy chủng. Sau 4 ngày, màu NY5 đã bị loại bỏ từ
24,4 đến 33,3 %, còn màu NY1 giảm đi từ 13,4 - 15,6 %
Theo kết quả nghiên cứu Svobodová và cộng sự với chủng Irpex lacteus
917/93 cho thấy MnP tinh sạch từ chủng nấm này có khả năng loại màu 4 loại thuốc nhuộm khác nhau, hiệu suất loại màu thuốc nhuộm RO16 là 24,1%, 95% với RBBR, 88% với BPB và 39,5% với CuP sau 5 giờ. Nồng độ màu ban đầu là 25 mg/l, hoạt tính
MnP ban đầu là 80 pkat (1U = 16,67*103 pkat). Khả năng loại màu của MnP từ chủng
I. lacteus 917/93 cũng được so sánh với một số enzyme phân hủy lignin từ các chủng
nấm đảm khác, kết quả chứng minh được khả năng loại màu của MnP còn phụ thuộc vào cấu trúc của các loại màu tổng hợp [68]. Xác định hoạt tính MnP thơ cịn lại trong q trình loại màu sau 4 ngày. Kết quả ở bảng 3.4
Bảng 3.4 Hoạt tính enzyme MnP thơ cịn lại trong quá trình loại màu sau 4 ngày
Đối
chứng
NY1 NY3 NY5 NY7 NY8 IN13 IN22
Sau 4 ngày loại màu 140 (U/l) 89,7 103,1 91,9 85,2 85,2 88,2 133,0
Màu IN22 hoạt tính MnP giảm ít, đồng nghĩa với khả năng loại màu rất thấp khi so sánh với phần trăm loại màu của MnP thô. Chú ý nhất đối với màu NY5, hoạt tính enzyme giảm 34 % nhưng hiệu suất loại màu chỉ đạt 24,4 - 33,3 %. Màu NY1 hoạt tính MnP giảm 36 %, hiệu suất loại màu là 13,4 - 15,6 % sau 4 ngày lắc.
Hoạt tính enzyme thơ là yếu tố quan trọng trong q trình loại màu nhưng đặc tính và cấu trúc hóa học của các loại màu cũng ảnh hưởng khơng nhỏ tới khả năng loại màu của enzyme. Cấu trúc hóa học của NY3 có 3 vịng benzen đơn giản hơn cấu trúc hóa học của IN22, cấu trúc hóa học của NY5 và NY1 đều có 5 vịng benzen nhưng cấu tạo khác nhau (Trình bày trong phần I.1.4) do đó khả năng loại màu của MnP sẽ khác nhau. Cần rất nhiều nghiên cứu để chọn lọc các yếu tố để enzyme MnP thơ hoạt động có hiệu quả trong các mơi trường có thuốc nhuộm.
III.7 Một số tính chất của enzyme MnP thơ từ chủng FBH11 III.7.1 pH tối ưu và độ bền pH
III.7.1.1 pH tối ưu
Độ pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng enzyme. Bởi pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa các gốc R+ axit amin trong phân tử enzyme, trạng thái ion hóa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động và trạng thái ion hóa cơ chất.
Để tìm ra pH tối ưu cho hoạt động của MnP thô từ chủng FBH11, đệm PPB ở các pH
khác nhau (pH 2 - pH 8) đã được sử dụng. Kết quả định tính thể hiện ở hình 3.26, hoạt tính MnP mạnh hay yếu được thấy rõ thơng qua độ tím đậm hay nhạt của sản phẩm tạo thành (sự oxy hóa phenol đỏ). So với mẫu đối chứng thì màu ở các mẫu có MnP đậm
hơn, như vậy cho thấy enzyme MnP hoạt động xúc tác phản ứng trong khoảng pH
rộng. Kết quả định lượng hoạt tính MnP ( Hình 3.27) thể hiện rõ hơn kết quả này, hoạt tính MnP ở các pH đệm khác nhau dao động không đáng kể. Ở pH 4 hoạt tính MnP cao nhất là 144,7 U/l. Như vật pH này là pH tối ưu cho hoạt động của MnP từ chủng FBH11.
Hình 3.26 pH tối ưu của MnP từ chủng FBH11
So sánh với kết quả nghiên cứu của Mtui và Masalu (2008), lồi Laetiporus sulphureus có pH tối ưu đối cho hoạt động của MnP thô là pH 4,5. Hoạt tính MnP của
chủng này giảm dần khi tăng pH đệm, ở pH 8 hoạt tính MnP rất thấp trước khi mất
hoàn toàn ở pH 9. Shin và cộng sự, Nakamura và đồng tác giả cũng đã chứng minh
khả năng oxy hóa cơ chất tốt nhất của MnP từ 2 loài Bjerkandera adusta và Pleurotus
ostreatus là pH axít. U/l 140.1 139.3 136.3 138.4 137.5 138 144.7 132 134 136 138 140 142 144 146 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 pH đệm
Hình 3.27 Ảnh hưởng của pH đệm lên hoạt tính của MnP từ chủng FBH11
III.7.1.2 Độ bền pH
Do pH mơi trường có ảnh hưởng tới độ bền của enzyme cho nên việc xác định độ bền pH cho enzyme có ý nghĩa quan trọng trong q trình thu nhận, tinh sạch và
bảo quản enzyme.
Hoạt tính enzyme cịn lại sau 3 giờ ủ ở pH khác nhau được trình bày ở bảng 3.5 cho thấy MnP bền trong khoảng 2 - 4. Ở pH 4 hoạt tính MnP chỉ mất 4,2 % trong khi
đó ở pH 2 và pH 3 hoạt tính giảm từ 6,9 - 7,5 %. Ở các pH cịn lại hoạt tính bị giảm từ