II Manganes Peroxidase 1 Khái niệm
6.Phân bố của MnP và một số vi sinh vật sinh MnP 1 MnP sinh ra từ nấm đảm
6.1 MnP sinh ra từ nấm đảm
Cho tới nay có khoảng trên 60 lồi nấm đảm đã được nghiên cứu về khả năng
sinh MnP như: P. chrysosporium, Trametes versicolor, Phlebia radiata, Nematoloma frowardii .v.v..
MnP được nghiên cứu lần đầu tiên năm 1984 ở loài nấm đảm P. chrysosporium.
Một số gene mã hóa MnP của nấm P. chrysosporium đã được công bố là mnp1, mnp2,
mnp3, mnp4, mnp5 trong đó 3 gene mnp1 (mã hóa MnP H4) đã được biểu hiện ở A.
niger và A. oryzae, mnp2 (mã hóa MnP H5) và mnp3 (mã hóa MnP H3) được nghiên
cứu nhiều nhất. MnP tái tổ hợp (từ mnp1 của P. chrysosporium) cũng được biểu hiện thành công ở nấm men Pichia Pastoris αMnP1-1 và đã được lên men gián đoạn [49].
Enzym MnP oxi hóa các hợp chất phenolic bằng việc sử dụng cặp oxi hóa khử trung gian Mn2+ / Mn3+ và Mn3+ làm ổn định các phối tử của nấm chẳng hạn oxalic acid và phức Mn3+ oxi hóa các hợp chất phenolic. MnP khi có mặt của sodium malnonate, Mn2+ và H2O2 sẽ xúc tác cắt liên kết Cα - Cβ, Cα oxy hóa và cắt liên kết alkyl - aryl của cấu trúc lignin chứa phenolic beta-1 và beta-O-4. Phức Mn3+ có trọng lượng phân tử thấp sẽ khuyếch tán và oxi hóa các chất trung gian, tấn công cấu trúc phenolic của lignin. Hệ thống MnP-lipid đủ mạnh để phân hủy các liên kết Cα-Cβ và beta-aryl các hợp chất có cấu trúc tương tự lignin khơng có mạch vòng.
Nấm Nematoloma frowardii và Stropharia rugoannulata có khả năng chuyển
hóa và phân hủy các sản phẩm được khử từ TNT. Chúng khống hóa trực tiếp 4A26DNT thành CO2, giải phóng 52% CO2 khi có mặt của chất khử trung gian thiol (mediator). Nấm N. frowardii cịn được nghiên cứu có khả năng phân hủy các PAH như phenanthrene, anthracene, pyrenes, fluorene và benzo (a) pyrene ( Sack et al.,
2007).
6.2 MnP sinh ra từ nấm sợi
Cho tới nay chưa có nhiều nghiên cứu về nấm sợi có khả năng sinh MnP. Một số lồi được thơng báo có khả năng sinh MnP đều thuộc chi Asperillus như A. niger, terreus, nendunan (Kluczek-Turpeinen B., 2007).
A. terreus LD-1 có khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy lignin trong đó
có enzyme MnP. MnP này phản ứng trong những điều kiện kiềm, enzyme này được
tinh sạch có hoạt tính tăng 13 lần so với dịch enzyme thơ, hoạt tính enzyme trung bình 0.384 U/mg đối với từng loại cơ chất dùng để xác định. Trọng lượng phân tử MnP từ 43 - 44 Kda , có cấu trúc monomeric. pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của MnP từ chủng
A. terreus LD 1 là 12,5 và 370C. Enzym này ổn định hoạt tính trong khoảng 11 - 12,5 và 400C. Km của MnP đối với các cơ chất H2O2; 2,6 DMP và Mn2+ lần lượt là 320 pM, 20 pM and 33 µM at pH 12,5 [38].
Theo nhiều công bố trên thế giới thì các loại màu, thuốc nhuộm tổng hợp đóng vai trị như chất cảm ứng cho quá trình tổng hợp ligninolytic enzyme. Có rất nhiều
màu có cấu tạo đa vịng với cấu trúc tương tự tiền chất tạo lignin, khi đó các enzyme
peroxidase được vi sinh vật tổng hợp để phân hủy những hợp chất màu này thành các
chất đơn giản hơn (Shin et al., 1997, Mei et al., 2008). Chủng nấm sợi A. alliaceus
121C được nuôi cấy trong môi trường lỏng chứa màu Indigo và Congo đỏ đã sinh tổng hợp cả 3 loại enzyme Lac, LiP và MnP, tuy nhiên hoạt tính MnP thấp hơn đạt 10-12 U/l [40].
Theo một số nghiên cứu đồng thời tại phịng Cơng nghệ Sinh học môi trường- Viện Công nghệ sinh học từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin, chủng nấm sợi
Aspergillus sp. FDNR14 có khả năng sinh MnP trên các môi trường khác nhau và hoạt
tính MnP tương đối cao, trên mơi trường SH1 hoạt tính đạt 538 U/l, cao nấm men hoạt tính đạt 504 U/l và 29 U/l trên mơi trường cao malt. Chủng Aspergillus sp. FNA1 phân
năng sinh MnP và Lac lần lượt là 26,9 U/l và 5,4 U/l [1]. Chủng nấm sợi Aspergillus
sp. FNA33 có quan hệ gần gủi với chủng Aspergillus terreus LD-1, enzyme MnP thu
được có khả năng hoạt động ở điều kiện rất kiềm pH từ 11 đến 12,5. Hoạt tính MnP (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
của chủng FNA33 sau 7 ngày nuôi cấy đạt 434,5 U/l và sau 20 ngày thì hoạt tính giảm còn 269 U/l [4]. Chủng nấm sợi Trichoderma sp. FDNR40 trên mơi trường SH1 chứa anthracene cho hoạt tính MnP cao nhất (12,3 U/l), trên mơi trường Czapek nghèo thì hoạt tính MnP lại thấp hơn đáng kể cả trên 5 nguồn chất ơ nhiễm nghiên cứu, hoạt tính MnP cao nhất đạt 2,2 U/l trên 2,4,5-T [7].
6.3 MnP sinh ra từ vi khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật được nghiên cứu khá nhiều về khả năng sinh
MnP. Các chi Streptomyces, Norcadia và các đại diện thuộc chi được nghiên cứu
nhiều, trong đó các lồi thuộc chi Streptomyces được phát hiện nhiều hơn và có khả
năng sinh MnP. Như S. lavendulae REN-7, S. viridosporus, S. psammoticus, S. Reticuli.
Đặc điểm enzym MnP của lồi xạ khuẩn S. psammoticus có hoạt tính tốt nhất
tại pH 7, ở 30 0C. Loài xạ khuẩn này sinh tổng hợp MnP tốt nhất với nồng độ MnSO4 là 1,75 mM hoạt tính đạt tới 3060 U/l, khi giảm nồng độ MnSO4 lần lượt là 1,5 mM, 1,25 mM, 1 mM thì hoạt tính MnP giảm theo và hoạt tính tương ứng là 2500 U/l, 1250 U/l, 700 U/l, khi tăng nồng độ MnSO4 là 2,0 mM trong mơi trường thì hoạt tính giảm
xuống đến 900 U/l [54].
Chủng Streptomyces sp. XKDNR1 phân lập từ xử lý đất nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin ở Đà Nẵng bằng bioreactor có khả năng sinh MnP với hoạt lực là 33,625 U/l và LiP 124,7 U/l trên môi trường mà chất cảm ứng là dịch chiết đất chứa dioxin [9].
6.4 MnP sinh ra từ vi khuẩn
Hiện nay chưa có nhiều tài liệu công bố về enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (LiP và MnP) từ vi khuẩn, nhất là các vi khuẩn phân lập từ nguồn ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin.
Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn Brevibacillus sp. BDNR10 phân lập cũng từ bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Đà Nẵng thì hoạt tính MnP mạnh hơn so với LiP và Lac ở trên cả 4 chất ô nhiễm, ngoại trừ dịch chiết đất. Trong đó, cao nhất trên mơi trường chứa 2,4-D (15,7 U/l) và thấp nhất trên môi trường chứa 2,4,5-T (0,75 U/l) [7].
Theo công bố của Đặng Thị Cẩm Hà và đồng tác giả (2009), chủng vi khuẩn
Pseudomonas sp. BQNR phân lập từ ô nhiễm dầu ở Quảng Ninh cũng sinh tổng hợp enzyme MnP với hoạt tính đạt 215 U/l. Cùng với công bố này, chủng vi khuẩn
Achromobacter sp. BQNT2 sinh MnP có hoạt lực rất thấp 3-5 U/l. Trên thế giới, hoạt
tính enzyme thủy phân lignin của những chủng mới phân lập ban đầu cũng không cao, chỉ sau khi tối ưu hóa các thành phần mơi trường thì hiệu quả sinh tổng hợp enzyme thủy phân lignin mới tăng lên.
Gần đây nhất, theo công bố của Nguyễn Quang Huy và cộng sự (2010), sáu chủng vi khuẩn bao gồm BDNP1, BDNP2, BDNP3, BDNP4, BDNP5 và BDNP6 được phân lập từ các công thức xử lý sinh học tẩy độc đất nhiễm chất diệt cỏ tại sân bay Đà Nẵng. Khi khảo sát khả năng sinh MnP từ các chủng phân lập được thì chỉ có chủng BDNP6 là khơng sinh MnP, 5 chủng cịn lại đều sinh MnP hoạt tính lần lượt là 10,4 U/l, 7,4 U/l, 3,3 U/l, 17,2 U/l và 9,7 U/l. Phân loại chủng BDNP2 bằng kỹ thuật xác
định trình tự gen 16S rRNA kết hợp với các đặc điểm hình thái thì nó được xếp vào
chi Klebsiella và có tên là Klebsiella sp. BDNP2. Các nghiên cứu trước đây cho thấy,
chưa có chủng vi khuẩn thuộc chi Klebsiella phân lập được từ khu đất nhiễm chất độc hóa học tại sân bay Đà Nẵng (Nguyễn Bá Hữu et al., 2008).
PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I Vật liệu I Vật liệu
I.1 Nguyên liệu
Đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin từ sân bay Biên Hòa được thu thập trộn đều sử
dụng là nguyên liệu để phân lập các chủng nấm sợi. Chủng nấm sợi FBH11 được lấy từ bộ sưu tập giống của nhóm nghiên cứu POP thuộc phịng Cơng nghệ sinh học môi
trường - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam để tiến hành trong cơng trình này.
Chủng này đã được phân loại và đặt tên khoa học là Aspergillus sp. FBH11 [19] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
I.2 Hoá chất
Các hoá chất được sử dụng để nghiên cứu bao gồm các hoá chất nhập từ các hãng hoá chất như: Sigma, Merk v.v.
Dịch chiết đất (DC) chứa hơn 99% đồng phân 2,3,7,8,-TCDD; 2,4,5-T; 2,4-D và các PAHs như: pyrene; anthracene có độ tinh khiết cao dùng để phân tích, đánh giá khả năng phân huỷ các chất ô nhiễm bởi các chủng vi sinh vật.
Các hoá chất được sử dụng trong việc xác định hoạt tính enzyme MnP, LiP và Lac như: ABTS; 2,4-DCP (2,4-dichlorophenol); 4-aminoantipyrine; phenol red v.v.