II Phương pháp nghiên cứu
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
III.1 Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 4 chủng nấm sợi FBH11, FBH14, FBH33, FBH34
Hình thái khuẩn lạc các chủng nấm được phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
ở sân bay Biên Hòa đã được nghiên cứu dựa vào sự khác nhau về hình thái. Bằng
phương pháp pha lỗng và làm sạch chúng tơi đã phân lập được ba chủng nấm đặt tên
lần lượt là FBH14, FBH33, FBH34 từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay
Biên Hòa và chủng FBH11 từ bộ sưu tập giống của nhóm nghiên cứu POP thuộc
phịng Cơng nghệ sinh học mơt trường. Quan sát và miêu tả đặc điểm hình thái sau 7 ngày nuôi cấy ở 30°C trên môi trường Czapek thạch có bổ sung 2,4-D (Bảng 3.1)
Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm đã được phân lập
Tên
chủng Đặc điểm hình thái Môi trường Czapek
FBH11
+ Khuẩn ty khí sinh giai đoạn đầu có màu trắng sữa sau 8-10 ngày chuyển dần
sang màu xanh đen, phía trên bề mặt
xuất hiện nhiều đốm trắng nhỏ lan rộng, bề mặt khuẩn lạc nhẵn.
+ Khuẩn ty cơ chất bám chặt, có màu trắng đục.
FBH14
+ Khuẩn ty khí sinh màu xanh thẫm trong suốt quá trình phát triển, bề mặt phẳng, bơng xốp, rìa ngồi xuất hiện khuẩn lạc màu trắng, ở giữa khuẩn lạc có núm lồi lên.
+ Khuẩn ty cơ chất màu đỏ đen, lan
FBH33
+ Khuẩn ty khí sinh màu xám xanh, rìa ngồi có màu trắng sữa, bề mặt khuẩn lạc phẳng, xuất hiện nhiều giọt tiết màu
đen lan rộng và đều.
+ Khuẩn ty cơ chất màu trắng đục, bám chắc và lan rộng, tạo đường khía cạnh từ tâm lan ra mép.
FBH34
+ Khuẩn ty khí sinh từ màu trắng sữa ở giai đoạn đầu và chuyển dần sang màu xanh đen sau 8-10 ngày trong quá trình
phát triển, bề mặt lồi, bông xốp và tạo nhiều vòng tròn đồng tâm, trong xanh đen ngoài trắng sữa, xuất hiện nhiều giọt
tiết màu đỏ sau 8-10 ngày nuôi cấy. + Khuẩn ty cơ chất màu đen đỏ lan rộng.
Chú thích: Các chủng nấm FBH11, FBH14, FBH33, FBH34 phát triển trên môi trường
Czapek + 2,4-D, bổ sung phenol đỏ (0,03%).
Quan sát hình thái nấm phát triển trên môi trường Czapek (Bảng 3.1) thấy chúng
đều có khả năng thuộc nhóm nấm sợi. Chúng có hình thái khuẩn lạc rất đa dạng đặc
biệt là có màu sắc khác nhau.
III.2 Khảo sát, sàng lọc khả năng sinh tổng hợp 3 loại enzyme ngoại bào MnP,
LiP và laccase
Hai chất chỉ thị màu là guaiacol (0,01%) và phenol đỏ (0,03%) đã được sử dụng để sàng lọc khả năng sinh tổng hợp 3 loại enzyme ngoại bào MnP, LiP và laccase từ 4
chủng nấm sợi đã được phân lập và tuyển chọn. Kết quả ở hình 3.1 cho thấy, tất cả 4
chủng nấm này đều phát triển tốt và đều có khả năng sinh 3 loại enzyme ngoại bào. Tuy nhiên sự phát triển của từng chủng nấm và chuyển đổi màu chất chỉ thị không thể đánh giá hết được khả năng sinh enzyme ngoại bào của chúng. Xét về mặt cảm quan
có thể thấy rằng: chủng FBH11 phát triển tốt nhất và sinh enzyme ngoại bào cao nhất.
Để kiểm chứng điều này, dịch nuôi cấy sau 7 ngày của 4 chủng nấm đã được tiến hành xác định hoạt tính của 3 loại enzyme. Kết quả cho thấy tất cả 4 chủng FBH11, FBH14,
có khả năng sinh tổng hợp MnP, LiP và laccase cao nhất lần lượt là: 46,5 U/l; 37,2 U/l và 5,1 U/l (Bảng 3.2). Kết hợp khả năng phát triển và sinh enzyme ngoại bào, chủng
FBH11 đã được chọn lọc để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Tên chủng Chủng FBH11 Chủng FBH14 Chủng FBH33 Chủng FBH34 Guaiacol Guaiacol Phenol đỏ Phenol đỏ Ghi chú ++++ +++ +++ +++
++++ Phát triển rất tốt +++ Phát triển tốt ++ Phát triển trung bình + Phát triển yếu
Hình 3.1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 4 chủng chọn lọc
Hoạt tính MnP, LiP và laccase của 4 chủng nấm sau 7 ngày ni lắc trên mơi trường Czapek nghèo có bổ sung 2 chất chỉ thị là phenol đỏ (0,03%) và guaiacol (0,01%) được trình bày trong bảng 3.2:
Bảng 3.2 Hoạt tính MnP, LiP và laccase của 4 chủng nấm được tuyển chọn
Môi trường Czapek 1/5 + Phenol đỏ Chủng FBH11 Chủng FBH14 Chủng FBH33 Chủng FBH34 MnP (U/l) 46.5 33.7 22.7 37.1 LiP (U/l) 37.2 35.8 22.1 34.9 Laccase (U/l) 5.1 1.8 4.8 3.4 Môi trường Czapek 1/5 + Guaiacol FBH11 FBH14 FBH33 FBH34 MnP (U/l) 45.7 38.2 38.2 41.9 LiP (U/l) 6.0 10.2 8.1 14.3 Laccase (U/l) 3.3 11.8 2.3 2.7
Trong cơng trình nghiên cứu của tôi, Nguyễn Nguyên Quang và cộng sự đã
phân loại FBH11 bằng sự kết hợp giữa các đặc tính hình thái và trình tự đoạn gen 18S rRNA. Chủng được đặt tên là Aspergillus sp. FBH11 [19].
III.3 Lựa chọn và tạo điều kiện mơi trường thích hợp cho khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp MnP của chủng FBH11
III.3.1 Lựa chọn môi trường thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzyme MnP của chủng FBH11
Hiện nay, ba loại enzyme LiP, MnP và laccase được nghiên cứu nhiều nhất chủ yếu trên các chủng nấm đảm như Phanerochaete chrysosporium [29, 36], Trametes versicolor 9522-1 [67]. Ngồi ra cũng có một số nghiên cứu trên các chủng nấm sợi Trichoderma viride [74] , Aspergillus ochraceus NCIM-1146 [55] , Penicillium
ochrochloron MTCC 517 [65] , Aspergillus allaceus 121C [40] , Trichoderma harzianum WL1 [61], xạ khuẩn (chủ yếu thuộc chi Streptomyces) và vi khuẩn Bacillus subtilis, licheniformis, halodurans ; Brevibacillus laterosporus MTCC 2298 [43].
màu thuốc nhuộm, phân hủy lignin v.v.. còn các nghiên cứu về phân hủy những hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm như PAH, TNT, HCH, PCB, phenol v.v.. lại rất ít [23] và hầu hết tập trung ở nấm đảm với loài nấm trung tâm là P. chrysosporium, chúng có khả
năng khống hóa rộng các hợp chất khó phân hủy [29, 36].
Do đó, việc tìm ra được các loại enzyme ngoại bào kể trên từ các chủng vi sinh
vật phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin đã được đặt ra. Các kết quả thu được sẽ
sử dụng nhằm thúc đẩy hiệu quả khử độc các khu vực đang bị ô nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin và áp dụng cho các loại hình ơ nhiễm các chất vịng thơm. Và việc chọn lọc
được mơi trường nuôi cấy cho chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme là rất quan
trọng. Chủng nấm sợi FBH11 sau khi nuôi cấy và làm giàu trên môi trường Czapek
nghèo, được chuyển vào bình tam giác thể tích 250 ml chứa 50 ml mơi trường dịch
chiết khoai tây (PE), dịch chiết cà chua, cao malt (20 g/l) (ME), cao nấm men (YE),
môi trường YMPG (yeast extract - malt extract - pepton - glucose), mơi trường cơ bản
(basic medium) có mặt 2,4-D để sàng lọc và khảo sát chọn mơi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme MnP là cao nhất. Kết quả khảo sát và chọn lọc môi
trường sau 12 ngày nuôi được thể hiện ở hình 3.2
31.8 14.2 14.2 45.2 10.5 30.2 19.6 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
5 7 9 11 Thời gian (ngày)
H o ạ t tí n h M n P ( U /l ) Czapek 1/5 Dịch chiết malt Dịch chiết khoai tây Dịch chiết cà chua YMPG Basic medium Cao nấm men
Hình 3.2 Ảnh hưởng của các mơi trường nuôi cấy khác nhau lên khả năng sinh enzyme MnP của chủng FBH11
Kết quả ở hình trên cho thấy trên môi trường cao malt enzyme MnP có hoạt
tính cao nhất sau 7 ngày nuôi (45,2 U/l), mặt khác sự biến động hoạt tính enzyme đáng kể từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 11. Trong khi đó trên mơi trường dịch chiết khoai tây hoạt tính MnP cao nhất sau 7 ngày nuôi (30,2 U/l) và biến động theo xu hướng giảm dần hoạt tính trong suốt q trình ni cấy. Trên các mơi trường cịn lại khơng thấy sự biến động đột biến về hoạt tính MnP, cao nhất là mơi trường YMPG sau 10 ngày ni
hoạt tính MnP chỉ đạt 20,1 U/l và giảm dần trong những ngày nuôi cấy tiếp theo. Từ kết quả thu được môi trường cao malt là môi trường phù hợp cho chủng FBH11 sinh tổng hợp enzyme MnP có hoạt tính cao nhất.
Chủng Trichoderma sp. FDNR40 phân lập từ bioreactor xử lý chất diệt cỏ/dioxin ô nhiễm đất ở Đà Nẵng có khả năng phát triển trên cả mơi trường SH1 và
Czapek. Trên mơi trường SH1, hoạt tính MnP cao nhất là 12,33 U/l trên anthracene,
trên môi trường Czapek nghèo, hoạt tính MnP cao nhất trên 2,4,5-T (2,24 U/l). Sử dụng môi trường giàu MEG với chất cảm ứng 2,4,5-T và CuSO4 nhưng MnP đã không phát hiện được [7].
Năm chủng nấm Fusarium solani khi được nuôi cấy trên môi trường dịch đã
khơng có hoạt tính enzyme LiP, trong khi đó hai hoạt tính MnP và MIP (manganese independent peroxidase) có hoạt tính thấp (0,3-0,5 mU/ml) đã được phát hiện
(Saparrat et al.,2000). Ngoài ra, chủng A. terreus LD-1 có khả năng sinh MnP trong
điều kiện kiềm, hoạt tính trung bình đạt 0,384 U/mg (Nozomi et al., 2002).
III.3.2 Mối quan hệ giữa sinh trưởng và khả năng sinh MnP của chủng FBH11 theo thời gian
Mục đích của thí nghiệm này là xác định tại thời điểm nào thì lượng enzyme
ngoại bào MnP sinh ra cao nhất và thu dịch enzyme nuôi cấy phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2648 2745 3244 3244 3580 4382 4794 4880 4687 13,9 14,9 15,6 16,2 17,9 25,5 38,1 28,2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 1 2 3 4 5 6 7 8 H o ạ t t ính M nP U /l T r ọ ng l ư ợ ng khơ (m g /l )
Thời gian (ngày)
Sinh
khối
Hoạt
tính MnP
Hình 3.3 Mối quan hệ giữa sự phát triển và sinh MnP của chủng FBH11 trên môi trường cao malt sau 8 ngày
Lượng sinh khối và khả năng sinh MnP của chủng FBH11 cho thấy chủng
FBH11 phát triển và đạt lượng sinh khối cao nhất sau 7 ngày nuôi lắc, sinh khối giảm sau ngày nuôi cấy tiếp theo. Đồng thời tại thời điểm này hoạt tính MnP thu được đạt giá trị cao nhất. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng FBH11 pha log kéo dài 4-5 ngày, trong giai đoạn này chủng FBH11 chủ yếu sử dụng các chất dinh
dưỡng có trong mơi trường để sinh bào tử, tăng sinh khối, đồng thời sinh tổng hợp các
loại enzyme để phân cắt các thành phần cơ chất có trong mơi trường phục vụ cho q trình sinh trưởng và phát triển. Thông thường đối với nấm, lượng enzyme đạt cực đại vào thời điểm cuối pha logarit, điều này phù hợp với kết quả thí nghiệm ở chủng
FBH11. Hoạt tính MnP cao nhất tại thời điểm này là 38,1 U/l, sinh khối đạt cực đại 4887 mg/l (Hình 3.3). Do đó dựa vào đường cong sinh trưởng và sinh enzyme của
chủng FBH11, chúng ta xác định được thời gian thu dịch enzyme thích hợp nhất. Có thể nhận thấy, pha cân bằng tồn tại trong thời gian rất ngắn do giai đoạn này thiếu nguồn dinh dưỡng cho quá trình sinh tổng hợp các tế bào mới, hàm lượng sinh khối giảm, đồng nghĩa với việc giảm khả năng tổng hợp MnP, hoạt tính giảm từ 38,1 U/l xuống 28,2 U/l.
Theo nghiên cứu của Jiménez-Tobon và đồng tác giả về chủng P. chrysosporium cho thấy không thấy sự xuất hiện của enzyme MnP sau 4 ngày nuôi cấy, mặc dù sinh khối phát triển mạnh và hoạt tính MnP cao nhất sau 7 - 8 ngày nuôi cấy và giảm ngay sau những ngày nuôi cấy tiếp theo, tuy nhiên hàm lượng sinh khối vẫn có chiều hướng tăng [36]. Điều này cho thấy, sự phát triển sinh khối và sinh enzyme MnP khơng phải lúc nào cũng có quan hệ tỷ lệ thuận. Như vậy, đối với chủng FBH11 sau 7 ngày nuôi cấy, cho sinh khối đạt cực đại và hoạt tính enzyme MnP cao nhất.
III.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và khả
năng sinh MnP
III.3.3.1 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
pH môi trường là một trong những yếu tố quan trọng không những ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển mà còn ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme
ngoại bào của vi sinh vật. Dải pH 2 - 9 đã được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và sinh enzyme MnP của chủng nấm FBH11. Kết quả sau 7 ngày ni cấy cho thấy chủng FBH11 có khả năng phát triển tốt trong dải pH rộng, từ mơi
trường có pH thấp (pH 3) đến mơi trường có pH cao (pH 9) và tốt nhất trong khoảng
pH 4 - 8, (Hình 3.4). Bên cạnh đó, một vài nghiên cứu khác đối với chủng nấm FBH11 trên môi trường Czapek nghèo cho thấy sự phát triển của chủng nấm trong khoảng pH 4 - 6 là tốt nhất. Một số vi sinh vật cũng phát triển trên mơi trường có chứa 2,4-D và pH axít nhẹ là khoảng phát triển của chúng. Các chủng Aspergillus sp. FDN20 ở pH 6 [6], chủng Aspergillus terreus FDN41 ở pH 6,5 cho sinh khối phát triển tốt nhất.