Sau này quan sát dưới kính hiểm vi, hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma
sp. được mô tả như sau: tại những điểm nấm Trichoderma sp. tiếp xúc với nấm gây
bệnh dã làm cho nấm gây bệnh teo lại và chết. Ngược lại ở những điểm khơng có sự
tiếp xúc của nấm Trichoderma sp. với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sp. sinh ra gây độc cho nấm
gây bệnh.
Cơ chế kháng sinh: nấm Trichoderma sp. có khả năng sinh ra một số kháng
sinh. Khả năng sinh ra chất kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau. Chúng gồm:
Gliotoxin: là chất kháng sinh được R.Weindling và O. Emerson mô tả năm
1936 do nấm Trichoderma lignorum tạo thành. Trichoderma sinh kháng sinh
Gliotoxin với điều kiện hàm lượng oxy phải cao. Chất Gliotoxin được tích luỹ nhiều
trong dịch mơi trường. Sự tích luỹ tối đa chất Gliotoxin thường ở giai đoạn phát triển
sớm của nấm Trichoderma. Chất Gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, pisi; Botrytis, R.solani).
Viridin: là chất kháng sinh thứ hai do nấm Trichoderma sp. tạo thành trong
hoạt động sống của chúng.Chất kháng sinh này được phát hiện vào năm 1945. Viridin độc hơn rất nhiều so với Gliotoxin và có hoạt tính chống nấm cao.
- 28 -
Ngồi ra, một số chất kháng sinh khác do nấm Trichoderma sp. sinh ra như: chất
kháng sinh U – 21693 được Meyer phát hiện năm 1996. Năm 1975, ở Nhật Bản, các
tác giả Atsushi, Shunsuke đã phát hiện được 2 chất kháng sinh: Trichodermin và Dermadin có trong dịch ni cấy loài T.koningii và T.aureoviride. Nấm Trichoderma
cịn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh dễ bay hơi có hoạt tính sinh lý cao. Theo Hutchinson (1973) thì thành phần chính của những chất này là khí Cacbonic (CO2) và ethanol (Seiketov, 1982).
Tác động của enzyme: nhiều lồi Trichoderma sp. có khả năng sinh ra enzyme
phân giải (như enzyme laminarinaza, chitinaza,…) (Score et al., 1994). Khi phát triển ở trên thành tế bào nấm vật chủ thì nấm Trichoderma sp. có thể tiết ra những
loại enzyme gây suy biến thành tế bào của nấm gây bệnh cho cây như enzyme β -(1- 3)-glucanase và chitinase.
Cơ chế cạnh tranh: nấm Trichoderma sp. có thể biểu hiện tính đối kháng
thơng qua việc cạnh tranh với nguồn gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú. Nấm
Trichoderma sp. thường định cư trước so với các nguồn gây bệnh cây. Do đó, chúng
chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nguồn gây bệnh (Green et al., 1996; Martin et al., 1985).
Hầu hết các cơ chế nêu trên về tính đối kháng của nấm Trichoderma sp. được
quan sát trong điều kiện phịng thí nghiệm. Tại Viện Bảo Vệ Thực Vật đã có các thí
nghiệm về tính đối kháng của nấm Trichoderma sp. (khả năng ký sinh, khả năng sinh các chất kháng sinh). Cơ chế tác động của nấm đối kháng Trichoderma sp. trong điều
kiện phịng thí nghiệm ở Việt Nam là rất có triển vọng cho việc nhân sinh khối nguồn nấm tạo ra chế phẩm sử dụng phòng trừ bệnh hại cây trồng (Viện Bảo Vệ Thực Vật, 2007).
1.3. MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA NẤM Trichoderma sp.
1.3.1. Lĩnh vực bảo vệ thực vật
Trichoderma sp. có hiệu quả nhất trong việc phòng trừ bệnh chết cây non, tạo
sinh khối trong đất và hệ rễ ngăn cản sự phát triển của nấm gây hại cây trồng bằng cách cạnh tranh, ký sinh trên nấm hoặc kháng sinh học. Ngồi ra, chúng cịn gây ảnh hưởng mạnh đến vi khuẩn (Hadar và ctv, 1984) và các loại nấm khác trong đất.
- 29 -
1.3.1.1. Bón vào đất
Đối với những bệnh hại do nấm, những bệnh liên quan dến các bộ phận nằm trong đất (thân ngầm và rễ) rất khó xử lý bằng phương pháp hóa học truyền thống.
Trichoderma sp. là loại vi sinh vật đối kháng mạnh với nấm gây bệnh trong đất và
được nhiều nghiên cứu ứng dụng như là một yếu tố kiểm soát sinh học. Cơ chế này chủ yếu nhờ vào độc tố (Trichodermin, viridian) do nấm tiết ra và ký sinh trực tiếp
trong nấm bệnh.
Phòng trừ bệnh chết ỉu trên cây họ đậu do nấm Rhizoctonia solani và Pythium
sp. gây ra. T. lignorum được bón vào trong các hốc cây con (7 – 8 tỷ bào tử/g chế
phẩm) cho thấy bệnh thối rễ giảm 2 – 3 lần và năng xuất tăng lên rõ rệt.
1.3.1.2. Xử lý hạt giống
Sử dụng Trichoderma sp. trong việc xử lý hạt giống có liên quan đến khả năng xâm nhập của nấm Trichoderma sp. vào trong đất. Phương pháp này cần một số
lượng lớn bào tử nấm để áp dụng. Tuy nhiên, đây là một phương pháp rất có ý nghĩa trong việc phòng trừ nấm bệnh ở giai đoạn từ khi gieo hạt đến giai đoạn cây con.
Khả năng phòng trừ sinh học của nấm T. hamatum có hiệu quả trên hạt giống đậu hà lan và củ cải đường, làm giảm bệnh rạp cây con do nấm R.solani và Pythium.ssp. (Haman và công tác viên năm 1980). Dòng nấm T.hazianum xử lý qua tia hồng ngoại (Papavizas và Lewis 1982) và T.viride có hiệu quả trong phịng trừ sinh học (Papavizas và Lewis, 1981). Hạt đậu nành được xử lý T.pseudokoningii và hạt bắp được xử lý T.harzianum có hiệu quả ngăn chăn mần bệnh và làm tăng năng suất trong việc phòng trừ nấm Rhizoctonia sp. Dùng T.harzianum xử lý hạt bông cho hiệu quả cao trong phòng trừ nấm R. solani tại Israel.
Hiệu quả thành công trong việc dùng Trichoderma sp. xử lý hạt giống ảnh hưởng
nhiều từ yếu tố phân lập (Papavizas và Lewis, 1981) tuổi của hạt giống gieo trồng (Kommedahi và Windels, 1981), nhiệt độ của đất (Harman và cộng tác viên, 1981), loại đất và vi sinh vật hiện diện trong đất (Hadar và cộng tác viên,1981), dinh dưỡng trong quá trình cấy nấm (Harman và ctv, 1981), mật độ nấm khi cấy vào đất (Nelson, 1975), tiềm năng gây bệnh hại cây trồng (Kommedahi và Windels,1981).
- 30 -
1.3.2. Lương thực và ngành dệt
Trichoderma sp. là những nhà máy sản xuất nhiều enzyme ngoại bào tử có hiệu
quả. Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzyme khác phân hủy polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng được sử dụng trong thực phẩm và ngành dệt.
1.3.3. Chất kiểm sốt sinh học
Hiện nay lồi nấm này được sử dụng một cách hợp pháp cũng như không được
đăng ký trong việc kiểm soát trên thực vật. Các chế phẩm Trichoderma sp. được sản
xuất và sử dụng như là chất sốt sinh học một các hiệu quả. Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng vừa tăng khả năng kháng bệnh cho cây.
1.3.4. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng
Nhưng lợi ích mà loại nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua. Bao gồm kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và sự phát triển mạnh hơn của bộ rễ thông thường. Những cơ chế giải thích cho hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ hơn trong thời gian gần đây. Hiện
nay, một giống Trichoderma sp. phát hiện chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ
mọc sâu (sâu hơn 1m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các lồi cây như bắp, cây cảnh có khả năng chống chịu được hạn hán.
Một số lồi nấm Trichoderma sp. có khả năng kích thích sự nảy mầm và ra hoa. Nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh rằng T.harzianum và T. konigii kích thích
sự nẩy mầm và sinh trưởng của cây.
1.3.5. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen
Nhiều vi sinh vật có khả năng kiểm sốt sinh học đều có chứa 1 số lượng lớn gen mã hóa các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm sốt sinh học. Nhiều
- 31 -
trong chuyển gen để tạo cây có khả năng kháng lại nhiều loại bệnh. Chưa có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen đang được nghiên cứu và phát triển. 1.3.6. Lĩnh vực xử lý mơi trường
T.hazianum có khả năng phân hủy các chất ô nhiễm trong đất rừng. Sự tồn tại
của các hợp chất chloroguaiacol, các hợp chất halogen thấm nước (AOX) trong chất thải nhà máy sản xuất bột giấy ở hồ Bonney, vùng đông nam nước Úc và các sản
phẩm phân giải của T.hazianum đã được nhiều nhà khoa học Van Leeuwen cùng
công tác viên nghiên cứu.
Chất tẩy trắng chlor của nhà máy sử dụng sulfite hóa bột giấy được tháo ra hồ một cách gián tiếp đã làm xuất hiện các hợp chất chlorophennol trong nước và cặn
bẩn. hợp chất chlorophennol rất độc. T.hazianum có khả năng làm giảm bớt sự tập
trung của các hợp chất tự do 2,4,6- tricholorophenol; 4,5 – di chlorophenol và cả AOX trong môi trường chứa muối khoáng. Loại nấm này cũng có khả năng đề halogen hóa tertra chloroguaiacol tự do trong mơi trường khống mặn.
T.hazianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chủng trên ciliatin,
glycophosphat và amino methyphosphonic acid (3 - methoxyphenyl). T.hazianum
(khoa sinh lý Trường Đại học california) có thể phân giải DDT, endosufan, pentachloronotrobenzen và pentachcholorophennol. Nấm này phân giải endosufan trong điều kiện dinh dưỡng khác nhau trong suốt quá trình sinh sống của nó.
1.4. KHẢ NĂNG TẠO CHẾ PHẨM CỦA NẤM Trichoderma sp.
1.4.1. Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm Trichoderma sp.
Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh học để trừ nấm bệnh, sâu hại cây trồng trong nông nghiệp. Người ta đã xây dựng những quy trình để thu nhận sản phẩm lên men khá hoàn chỉnh và được áp dụng vào thực tế sản xuất lớn ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, quy trình lên men vẫn đang còn nằm trong giai đoạn tim kiếm một phương pháp thích hợp, chọn lựa điều kiện và môi trường nuôi cấy tối ưu để đạt số lượng bào tử gồm chất khô cao, giá thành sản phẩm rẻ, đồng thời sản phẩm tạo ra rễ bảo quản, giữ được hoạt tính lâu bền ở nhiệt độ bình thường.
- 32 -
Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất vì đây là quá trình lên men đơn giản, dễ thành cơng hơn các quy trình khác. Trong quy trình này, các loại cơ chất dung để làm môi trường cho nấm đối kháng phát triển là cám trấu, bột gạo, bột bắp cùng với dịch dinh dưỡng để nuôi cấy nấm. Lên men xốp sẽ thu nhận được chế phẩm sinh học dạng đính bào tử (conidiospore) của các nấm đối kháng, ổn định và bền vững hơn dạng chlamydospores (bào tử chồi), vì vậy phương pháp này đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm từ lâu.
Khi nuôi nấm đối kháng trên môi trường xốp (hạt) Solivey F.F (1984), cho biết đã đạt hiệu suất bào tử so với các phương pháp lên men khác để chống sâu bệnh. Tuy nhiên, khả năng sống của bào tử trong chế phẩm phụ thuộc không chỉ vào điều kiện bảo quản mà cịn phụ thuộc vào sự sấy khơ và cơ chất dinh dưỡng. kết quả cho thấy
các chế phẩm sinh học nấm diệt sâu Metarrhhizium anisopliae và Bauverria
bassiana nếu bảo quản ở nhiệt độ từ 5 – 100C có thể giữ được hoạt tính 6 – 8 tháng. Ngược lại bảo quản ở nhiệt độ phịng thì chỉ giữ được 6 – 8 tuần. Như vậy các chế phẩm sinh học từ nấm được sản xuất ra cần phải được bảo quản trong điều kiện lạnh, nơi khơ ráo và sẽ có khả năng giữ được hoạt tính của chế phẩm 6 – 8 tháng.
Người ta cũng thường áp dụng quy trình lên men xốp để tạo sinh khối, đã áp dụng trong sản xuất để diệt các lồi nấm gây hại cây trồng. Bởi vì, mơi trường lên men xốp cho lượng bào tử/gram chế phẩm cao, quy trình đơn giản dễ thực hiện, giá thành sản phẩm tạo ra thấp, đáp ứng được nhu cầu của người nơng dân.
Để có được sản phẩm tạo ra có nhiều bào tử, các điều kiện mơi trường như độ ẩm tương đối khơng khí Rh = 95 %; nhiệt độ đạt 30 – 32oC và thời gian nuôi cấy 5 – 8 ngày.
Thành phần các loại môi trường dùng để lên men xốp, cũng là tạo chế phẩm
Trichoderma như sau:
(1) Bột gạo + bã đậu phộng (2) Cám gạo + bột ngô
(3) Cám gạo + bột ngô + bột đậu nành (4) Cám gạo + bột ngô + bã đậu khô
- 33 -
(5) Lúa nấu chín (6) Gạo nấu chín
Ngoài ra, các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tú (1997) còn thử nghiệm trên 3 loại
mơi trường khác để nhân sinh khối Trichoderma đó là:
(1) Mơi trường gồm các thành phần là cám, trấu. (2) Môi trường than, bùn.
(3) Môi trường bột thạch cao tẩm mật rỉ 10%.
Thí nghiệm được tiến hành trong cùng điều kiện về ẩm độ, nhiêt độ và thời gian
nuôi cấy và 2 dòng Trichoderma được chọn là Trichoderma 1 và Trichoderma 2. Kết
quả của thí nghiệm như sau:
Môi trường cám trấu cho sản phẩm Trichoderma có lượng bảo tử trong chế
phẩm khô đạt 109 bào tử/gram, số lượng bào tử cao nhất ở nhiệt độ phịng.
Mơi trường than bùn và bột thạch cao tẩm mật rỉ cho số lượng bào tử/gram chế phẩm khô thấp hơn, khoảng 107 – 108 bào tử/gram.
Tiếp tục thực nghiệm thời gian bảo quản của chế phẩm Trichoderma 1 và
Trichoderma 2 đã lên men từ môi trường cám trấu sau 3 tháng bảo quản ở nhiệt độ
phòng (29 – 32oC), tác giả Nguyễn Ngọc Tú (1997) cho biết số lượng số lượng bào
tử tính được/ gram chất khơ như sau: Trichoderma 2 còn 2,72.109 bào tử/gram so với ban đầu là 5,88.109 bào tử/gram và Trichoderma 1 còn 0,65.109 tế bào/gram so với ban đầu là 2,24.109 bào tử/gram.
1.4.2. Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm
Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm đã được thực hiện bởi Evlacchova (1968). Môi trường dinh dưỡng được nấu sôi ở 1000C, và khi
nguội cho thêm chất kháng sinh Streptomycine (0,01%) để ngăn cản sự phát triển của
vi khuẩn trong quá trình lên men.
Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp này có hiệu quả cần thực hiện 5 nguyên tắc chủ yếu sau:
(1) Bào tử nấm được cấy phủ kín khắp bề mặt môi trường dịch (đã đun sôi ở 1000C/20 phút). Các bào tử nấm sau khi cấy vào môi trường chúng phát triển nhanh
- 34 -
thành một màng mỏng khắp bề mặt môi trường, ngăn ngừa được khả năng nhiễm các vi sinh vật lạ.
(2) Lượng bào tử trên một đơn vị bề mặt môi trường được cấy với một lượng lớn đủ áp đảo được phát triển ban đầu của vi sinh vật lạ (1 – 2 tỷ bào tử/cm2).
(3) Ngay sau khi nảy mầm, bào tử của các nấm sẽ tiết ra các chất trao đổi chất, giống kháng sinh để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm lạ.
(4) Tạo môi trường pH thấp 5 – 5,5 thuận lợi hơn cho sự phát triển của nấm, ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
(5) Sử dụng dụng cụ, thiết bị và phịng ni cấy sạch sẽ hạn chế tối thiểu sự nhiễm của nấm ni.
Nói chung, hai phương pháp lên men này thì phương pháp lên men xốp đạt hiệu quả cao hơn, khả năng bị nhiễm vi sinh vật lạ thấp hơn.
1.4.3. Một số chế phẩm nấm Trichoderma đã được sản xuất và ứng dụng trên
thế giới và trong nước 1.4.3.1. Trên thế giới:
Nền nông nghiệp hiện đại với phương thức chỉ độc canh một vài lồi cây trồng trên diện tích rộng lớn, xem thuốc hóa học là một biện pháp tốt nhất để phòng trừ dịch hại trên cây trồng đã dẫn đến một loạt các hậu quả mà con người và thiên nhiên phải gánh chịu đó là:
Ơ nhiễm mơi trường, ơ nhiễm nguồn nước gây chết cho các động vật thủy sản, gia súc, gia cầm.
Làm mất cân bằng sinh thái trong tự nhiên; tạo nòi mới kháng thuốc ở côn trùng làm tăng thêm mức độ tàn phá trên cây trồng nhiều hơn.
Tồn dư thuốc hóa học quá mức cho phép trên sản phẩm nông nghiệp, gây hại tới sức khỏe con người.
Hơn nữa, sử dụng thuốc hóa học chi phí đầu tư cao nhưng ngày càng khơng hiệu quả.
Do đó, cần phải nhanh chóng giảm bớt lượng thuốc sử dụng hoặc chuyển sang chế phẩm vi sinh nhằm khắc phục các hậu quả trên.
- 35 -
Từ những thực tại đó, trên thế giới hiện nay đã có nhiều quốc gia sự dụng chế phẩm vi sinh để trừ sâu bệnh hại cây trồng. Theo Dunin (1979) ở Liên Xô cũ đã sử