PHẦN 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp đối kháng trực tiếp
2.2.2.1. Nguyên tắc
Tác động đối kháng của nấm Trichoderma với tác nhân gây bệnh nhờ cơ chế
cạnh tranh dinh dưỡng, nhờ cơ chế ký sinh hay tạo chất kháng sinh do chúng tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển.
- 40 -
2.2.2.2. Cách tiến hành
Chuẩn bị môi trường PGA: đổ vào các ống nghiệm, mỗi ống chứa 20ml môi trường. Hấp khử trùng 1210C trong 15 phút, để nguội 50 – 600C. Đổ 20ml môi trường trên vào các đĩa Petri vơ trùng kích thước bằng nhau.
2.2.2.3. Thí nghiệm
Cấy điểm chủng Trichoderma lên thạch đĩa petri, sau đó cách khoảng 3cm cấy điểm nấm bệnh lên đĩa cấy chủng Trichoderma. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 ngày,
quan sát, ghi nhận sự phát triển về kích thước (đường kính khuẩn lạc, thời gian tiếp xúc, ức chế). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và số liệu kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 3 lần, theo công thức:
KT = (a + b + c)/3
Trong đó: KT: kích thước đường kính khuẩn lạc trung bình.
a, b, c: lần lượt là đường kính khuẩn lạc của các lần thí nghiệm 1, 2, 3. Tóm tắc theo sơ đồ sau:
Hình 2.1: Thí nghiệm đối chứng trực tiếp.
2.2.2.4. Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm khả năng đối kháng trực tiếp của Trichoderma với nấm bệnh,
- 41 -
Đối chứng 1 Đối chứng 2 Thí nghiệm
T40 Phytophthora sp. T40 + Phytophthora sp.
T40 Fusarium sp. T40 + Fusarium sp.
T14 Fusarium sp. T14 + Fusarium sp.
T14 Phytophthora sp. T14 + Phytophthora sp.
2.2.3. Phương pháp lên men xốp thu nhận chế phẩm Trichoderma sp.
2.2.3.1. Mục đích
Số lượng bào tử/1 gam càng cao thì càng tốt. Quy trình thu nhận khá đơn giản, vật liệu dễ tìm, rẻ tiền.
2.2.3.2. Tiến hành thực nghiệm trên môi trường lên men xốp
Nấm Môi trường Độ ẩm (%)
Nhiệt độ
(0C) Thời gian
Trichoderma T40 Cám trấu 55 29 – 32 8 – 10 ngày
Trichoderma T14 Cám trấu 55 29 – 32 8 – 10 ngày
Ống giống
Nhân giống trong bình tam giác Lên men trong bình tam giác 250ml Ni 8 – 10 ngày, nhiệt độ 29 – 320C
Sấy nhẹ ở 400C trong 12h tới hàm lượng ẩm còn khoảng 8 – 10%
Xay cho chế phẩm được mịn
Bột Trichoderma
- 42 -
2.2.3.3. Cách tiến hành
Cấy vô trùng giống Trichoderma vào bình tam giác có sẵn mơi trường cám trấu
đã được hấp khử trùng và ủ trong khoảng 8 – 10 ngày ở nhiệt phòng cho đến khi nấm mọc xanh đều. Sau đó lấy sinh khối ra đem sấy ở nhiệt độ 400C tới hàm lượng ẩm còn 8 – 10% rồi cho vào bao nilông.
2.2.4. Phương pháp đếm số lượng bào tử trên 1 gam chế phẩm 2.2.5.1. Nguyên tắc 2.2.5.1. Nguyên tắc
Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. phương pháp này có đăc điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy. Phương pháp này có thể thực hiện bằng kỹ thuật trải đĩa hay đổ đĩa. Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha lỗng với mật độ tế bào thích hợp để các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính tốn. Mật độ tế bào quá lớn làm cho khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành màng sinh khối. Ngược lại, số lượng khuẩn lạc trên một đĩa quá nhỏ sẽ khơng có giá trị thống kê. Số lượng khuẩn lạc tối đa khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa.
2.2.5.2. Cách tiến hành
Cân 10g chế phẩm Trichoderma vào erlen chứa 90ml nước muôi sinh lý vô trùng
lắc đều, ta được huyền phù có độ pha lỗng là 10-1.
Cho vào máy lắc, trong 30phút, hút 1ml mẫu có độ pha lỗng 10-1, cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý vô trùng lắc đều ta được độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha lỗng mẫu bậc 10 để có các độ pha lỗng là 10-3, 10-4,..
Trải và ủ: cho 0,1ml dung dịch có độ pha lỗng thích hợp vào đĩa petri chứa sẵn môi trường. Dùng que trang đã khử trùng, trải đều dung dịch mẫu lên mặt thạch, lật ngược đĩa petri, gói lại. Đặt vào tủ ấm ở 300C trong 48h. Thực hiện tương tự các mẫu cịn lại.
- 43 -
Hình 2.2 : Phương pháp pha lỗng mẫu theo dãy thập phân.
2.2.5.3. Đọc và tính tốn kết quả
Ghi nhận các nồng độ pha loãng và đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa petri (sao cho từ khoảng 10 – 300 khuẩn lạc/đĩa). Nhân số khuẩn lạc với hệ số pha loãng và nhân với 10 để có mật độ bào tử/gam mơi trường ni cấy. Trung bình cộng số liệu các mẫu có độ pha loãng khác nhau và thể hiện mật độ pha lỗng ở dạng CFU/g mơi trường. Theo công thức:
A x 10 x 10 x n Trong đó: A: số khuẩn lạc trên đĩa
10: hệ số dung tích mẫu sử dụng 10: hệ số quy đổi về gam mơi trường n: hệ số pha lỗng.
- 44 -
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. HÌNH THÁI NẤM Trichoderma sp.
Quan sát hình thái dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40X, cho thấy cành bào tử của nấm không màu, sợi nấm khơng màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều. Bào tử có màu xanh, đơn bào hình trứng, trịn. Bào tử đính ở đỉnh của cành.
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc Trichoderma chủng T40 (40X).
3.2. KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG TRỰC TIẾP CỦA NẤM Trichoderma sp.
Trichoderma kháng lại nấm bệnh hại cây trồng bằng cơ chế cạnh tranh chất dinh
dưỡng, cơ chế ký sinh của nó trên nấm bệnh và cơ chế tiết ra một số chất kháng sinh ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh. Kết quả đối kháng của các chủng
Trichoderma trong thí nghiệm được trình bày như sau:
3.2.1. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma chủng T40 với nấm
Phytophthora sp.
Kết quan sát ở hình 3.2 cho thấy:
Sau 2 ngày nuôi cấy: nấm Phytophthora sp. phát triển khá nhanh, đường kính
khuẩn lạc đã đạt đến khoảng 40mm và khơng có sự khác nhau giữa lơ đối chứng và
lơ thí nghiệm. Tương tự, nấm Trichoderma chủng T40 cũng phát triển nhanh, đường
- 45 -
nghiệm. Điều này cho thấy, sau 2 ngày ni cấy, chưa có sự ảnh hưởng và ức chế lẫn
nhau của 2 chủng nấm Phytophthora sp. và chủng nấm T40.
Sau 4 ngày nuối cấy: Nấm Phytophthora sp. ở lơ thí nghiệm phát triển chậm
hơn so với lơ đối chứng. Đường kính khuẩn lạc của lơ thí nghiệm chỉ đạt 42mm so với 67mm ở lơ đối chứng. Chủng nấm T40 ở lơ thí nghiệm cũng có phát triển chậm hơn so với lô đối chứng (theo thứ tự là 43mm và 50mm). Điều này cho thấy rằng, trong điều kiện mơi trường thí nghiệm, ở giai đoạn này, sự phát triển của cả nấm bệnh và nấm đối chứng đều tác động, ảnh hưởng qua lại lẫn nhau. Trong đó, khả năng ức chế của nấm đối kháng cao mạnh hơn hẳn so với nấm bệnh.
Sau 6 ngày ni cấy: Đường kính khuẩn lạc của nấm Phytophthora sp. bị thu
hẹp lại so với trước và kém hơn hẳn so với đối chứng (chỉ còn 28mm so với 2 ngày trước đó là 42mm và đối chứng đã mọc kín đĩa petri). Trong khi đó, nấm T40 đã phát
triển kín bề mặt đĩa petri và vây quanh nấm Phytophthora sp. Điều này chứng tỏ
rằng, đến ngày thứ 6 sau khi cấy, chủng T40 đã ức chế hẳn sự sinh trưởng, phát triển
và tấn công tiêu diệt nấm Phytophthora sp.
Sau 8 ngày nuôi cấy: nấm bệnh Phytophthora sp. bị tiêu diệt hoàn toàn, biểu
hiện ở sự phủ kín tồn bộ bề mặt đĩa petri của chủng nấm T40.
- 46 -
Đối chứng Thí nghiệm
Ngày khi sau
cấy Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau
2
4
6
8
Hình 3.2: Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma chủng T40 với nấm Phytophthora sp.
3.2.2. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma (T40) với nấm Fusarium sp.
Kết quả quan sát hình 3.2 cho thấy:
Sau 2 ngày nuôi cấy: nấm Fusarium sp. phát triển chậm, đường kính khuẩn
lạc ở lơ thí nghiệm đạt đến khoảng 17mm so với 40mm ở lơ đối chứng và có sự khác
biệt giữa lơ đối chứng và lơ thí nghiệm. Tương tự, nấm Trichoderma chủng T40
cũng phát triển nhanh, đường kính khuẩn lạc cũng đạt khoảng 40mm ở cả mẫu đối chứng cũng như mẫu thí nghiệm. Điều này cho thấy, sau 2 ngày ni cấy, đã có sự
ảnh hưởng và ức chế lẫn nhau của 2 nấm Fusarium sp.và chủng nấm T40.
Sau 4 ngày nuối cấy: nấm Fusarium sp. ở lơ thí nghiệm phát triển chậm hơn
- 47 -
84mm ở lô đối chứng. Chủng nấm T40 ở lơ thí nghiệm cũng có phát triển chậm hơn so với lơ đối chứng (theo thứ tự là 43mm và 50mm). Điều này cho thấy rằng, trong điều kiện mơi trường thí nghiệm, ở giai đoạn này, sự phát triển của cả nấm bệnh và nấm đối chứng đều tác động, ảnh hưởng qua lại lẫn nhau. Trong đó, khả năng ức chế của nấm đối kháng cao mạnh hơn hẳn so với nấm bệnh.
Sau 6 ngày ni cấy: đường kính khuẩn lạc của nấm Fusarium sp. bị thu hẹp
lại so với trước và kém hơn hẳn so với đối chứng (chỉ còn 27mm so với 41mm so với 2 ngày trước đó và đối chứng đã mọc kín đĩa petri). Trong khi đó, nấm T40 đã phát
triển kín bề mặt đĩa petri và vây quanh nấm Fusarium sp. Điều này chứng tỏ rằng,
dến ngày thứ 6 sau khi cấy, chủng T40 đã ức chế hẳn sự sinh trưởng, phát triển và đã
bắt tấn công tiêu diệt nấm Fusarium sp.
Sau 8 ngày ni cấy: nấm bệnh Fusarium sp. bị tiêu diệt hồn tồn, biểu hiện
- 48 -
Đối chứng Thí nghiệm
Ngày khi sau
cấy Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau
2
4
6
8
Hình 3.3: Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma chủng T40 với nấm Fusarium sp.
3.2.3. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma chủng T14 với nấm
Phytophthora sp.
Kết quả quan sát ở hình 3.4 cho thấy:
Sau 2 ngày nuối cấy: nấm Phytophthora sp. phát triển nhanh và khơng có sự
khác biệt so với lơ đối chứng, đường kính khuẩn lạc đạt 40mm. Trong điều kiện mơi trường thí nghiệm, chủng T14 phát triển kém và kém hơn hẳn so với đối chứng, đường kính khuẩn lạc chỉ đạt 14mm so với 24mm ở mẫu đối chứng.
Sau 4 ngày nuôi cấy: nấm Phytophthora sp. vẫn phát triển nhanh, đường kính
khuẩn lạc đạt 70mm. Trong khi đó, chủng T14 chỉ đạt 23mm. Như vậy, cho đến 4
- 49 -
Sau 6 ngày nuôi cấy: nấm Trichoderma chủng T14 bắt đầu ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. Biểu hiển ở chổ, đường kính khuẩn lạc của nấm T14 tăng đến 26mm. Trong khi đó, đường kính của Phytophthora sp.chỉ còn 67mm (so
với 70mm của 2 ngày trước đó và đối chứng đã phát triển kín đĩa). Tuy nhiên, mức độ đối kháng này không cao.
Sau 8 ngày theo dõi: Tuy nấm T14 và tiếp tục ức chế nấm Phytophthora sp.
nhưng biểu hiện kém nên sinh viên không theo dõi tiếp và dừng lại ở đây.
Đối chứng Thí nghiệm
Ngày
Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau
2
4
6
8
Hình 3.4: Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma chủng T14 với nấm Phytophthora.
- 50 -
2.3.4. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma (T14) nấm Fusarium sp.
Kế quả ở hình 3.5 cho thấy:
Sau 2 ngày nuôi cấy: nấm Fusarium sp. phát triển nhanh, ở lơ đối chứng và thí nghiệm khơng có sự khác biệt, đường kính khuẩn lạc đạt 44mm. Nấm Trichoderma
chủng T14 phát triển khá chậm, ở lơ thí nghiệm đạt 14mm so với 24mm ở lô đối chứng.
Sau 4 ngày nuôi cấy: nấm Fusarium sp. vẫn phát triển nhanh, đường kính
khuẩn lạc đạt 75mm. Trong khi đó, chủng T14 ở lơ thí nghiệm chỉ đạt 24mm so với 30mm ở lô đối chứng. Như vậy, cho đến 4 ngày sau khi cấy, chủng nấm T14 chưa có
biểu hiện ức chế nấm Fusarium sp.
Sau 6 ngày nuôi cấy: nấm Trichoderma chủng T14 bắt đầu ức chế sự phát
triển của nấm bệnh. Biểu hiển ở chổ, đường kính khuẩn lạc của nấm T14 tăng đến
28mm. Trong khi đó, đường kính của Fusarium sp. chỉ cịn 64mm (so với 75mm của
2 ngày trước đó và đối chứng đã phát triển kín đĩa). Tuy nhiên, mức độ đối kháng này không cao.
Sau 8 ngày theo dõi: tuy nấm Trichoderma chủng T14 tiếp tục ức chế nấm
Fusarium sp. nhưng biểu hiện kém nên sinh viên không theo dõi tiếp và dừng lại ở
- 51 -
Đối chứng Thí nghiệm
Ngày
Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau
2
4
6
8
Hình 3.5: Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma T14 chủng nấm Fusarium. Bảng 3.1: Đường kính(mm) khuẩn lạc nấm Trichoderma và nấm gây bệnh. Ngày Phy Fu T40 T14 T14 + Phy T14 + Fu T40 + Phy T40 + Fu
2 43 40 39 24 14 ; 40 13 ; 44 41 ; 40 41 ; 17 4 67 84 50 30 23 ; 70 24 ; 75 43 ; 42 42 ; 30 6 90 90 70 40 26 ; 67 28 ; 64 59 ; 28 62 ; 27 8 90 90 90 71 32 ; 58 33 ; 60 90 ; 11 90 ; 10
- 52 - Nhận xét chung:
Thực nghiệm trên hai chủng nấm Trichoderma T40 và T14, sau 10 ngày theo dõi khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh. Dựa vào kết quả thực nghiệm ở bảng 3.1 cho thấy nấm Trichoderma chủng T40 tiêu điệt nấm
Phytophthora sp. và Fusarium sp. tốt hơn so với nấm Trichoderma chủng T14.
3.3. KẾT QUẢ LÊN MEN XỐP
3.3.1. Số lượng bào tử của các chủng thu nhận được sau 8 – 10 ngày nuôi cấy bằng phương pháp lên men xốp bằng phương pháp lên men xốp
Khả năng thu nhận sinh khối của các chủng nấm Trichoderma T14 và T40 bằng
phương pháp lên men xốp sau 8 – 10 ngày nuôi cấy kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: Sau 8 ngày nuôi cấy, số lượng bào tử của chủng T40 đã lên đến 6,2.109 bào tử/gam chế phẩm. Trong khi đó, chủng T14 đến 10 ngày nuôi cấy mới đạt đến 4,15.109 bào tử/gam phẩm.
Như vậy, ngoài khả năng đối kháng với nấm bệnh Phytophthora và Fusarium,
chủng T40 có khả năng nhân sinh khối tốt hơn hẳn so với chùng T14.
Bảng 3.2: Số lượng bào tử (bào tử/gam)Trichoderma trên môi trường nuôi cấy.
Chủng nấm
Trước khi sấy
Sau khi sấy (400C/12h)
Tỷ lệ (%) sống sót sau khi sấy
Trichoderma (T40) 6,2.109 4,8.109 77
Trichoderma (T14) 4,15.109 3,05.109 73
- 53 -
3.3.2. Tỷ lệ sống sót của bào tử sau khi sấy
Với thời gian có hạn, chúng tơi chỉ tìm hiểu tỷ lệ sống sót của bào tử nấm
Trichoderma sau khi sấy ở điều kiện nhiệt độ 400C trong 12h. Kết quả cho thấy, với điều kiện phịng thí nghiệm của trường Đại Học Kỹ Thuật Cơng Nghệ, tỷ lệ sống sót
của bào tử nấm Trichoderma đạt từ 70 – 80%. Theo chúng tôi, tỷ lệ này tuy khơng
thật cao nhưng có thể chấp nhận được và có thể khuyến cáo sử dụng điều kiện nhiệt
- 54 -
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN:
Qua quan sát thực hiện đề tài và những số liệu thu nhận được ta có thể đi đến kết luận sau:
Hai chủng nấm Trichoderma khảo sát đều có khả năng chống lại nấm bệnh bằng cách tiếp xúc trực tiếp nhưng khả năng tiêu diệt nấm bệnh của Trichoderma chùng T40 mạnh hơn so với chủng T14.
Khả năng sinh bào tử của nấm Trichoderma chủng T40 trên môi trường cám