NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
Áp dụng phương pháp phân tích trắc quang dùng phổ tồn phần kết hợp với thuật toán của chương trình lọc Kalman để xây dựng qui trình định lượng đồng thời paracetamol (PRC), clopheninamin maleat (CPM) và vitamin B1 (B1) trong thuốc giảm đau, hạ sốt Paracetamol FB có trên thị trường.
Các nghiên cứu cụ thể:
- Khảo sát trên toàn phổ từ 200 nm đến 900 nm để xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại phù hợp khi quét phổ.
- Tiến hành khảo sát sơ bộ phổ hấp thụ phân tử của PRC, CPM và B1 trong các dung mơi có pH = 1 đến 3 để tìm dung mơi thích hợp cho phép đo quang.
- Khảo sát sự ổn định độ hấp thụ quang của PRC, CPM và B1 theo thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp khi thực hiện các phép đo quang.
- Khảo sát sự ảnh hưởng của tinh bột đến độ hấp thụ quang của PRC, CPM và B1 .
- Kiểm tra tính cộng tính độ hấp thụ quang của hỗn hợp PRC, CPM và B1 trên toàn phổ.
- Khảo sát khoảng tuyến tính của PRC , CPM và B1 từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
- Xác định đồng thời nồng độ PRC, CPM và B1 trong các mẫu tự pha chế. - Xây dựng quy trình phân tích mẫu thuốc giảm đau - hạ sốt paracetamol FB, đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua việc tính tốn độ đúng và độ lặp lại của phép đo.
- Định lượng đồng thời nồng độ PRC, CPM và B1 trong mẫu thuốc paracetamol FB có trên thị trường. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua xác định độ thu hồi (Rev) của PRC, CPM và B1.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu
Nghiên cứu tài liệu về cơ sở của phương pháp phân tích trắc quang và một số tài liệu liên quan đến đề tài [8, 9,15]
2.2.2. Phương pháp thực nghiệm
Pha chế dung dịch chuẩn PRC, CPM và B1 và hỗn hợp của chúng
Tiến hành đo phổ hấp thụ phân tử của PRC, CPM và B1 trong vùng bước sóng khảo sát, ghi các dữ liệu và sử dụng chương trình lọc Kalman để tính tốn hàm lượng của PRC, CPM và B1 trong hỗn hợp tự pha và trong các mẫu thuốc.
2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích
2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền. Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phương trình hồi quy có cơng thức như sau:
y
3.S LOD =
B (2.1)
Trong đó:
Sy: là độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang.
2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác, có ý nghĩa định lượng với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95% và thường người ta sử dụng công thức:
y
10.S LOQ =
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các hỗn hợp PRC, CPM
và B1 tự pha chế thông qua sai số tương đối RE. Sai số tương đối của các phép phân tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thơng qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tính tốn được với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công thức: T i n h t o a n 0 0 C - C R E % = . 1 0 0 % C (2.3) Trong đó: RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử. CTinh toan (µg/mL) là nồng độ tính tốn được từ chương trình lọc Kalman. C 0 (µg/mL) là nồng độ đã biết của dung dịch PRC, CPM và B1 trong hỗn hợp.
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứu thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn. Độ thu hồi (Rev) được tính theo cơng thức sau:
R e = C - T .100% a
a
C
v (2.4)
Trong đó: CT: nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC hoặc CPM, B1 xác định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn.
Ca: nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC hoặc CPM, B1 xác định được trong mẫu khi chưa thêm chuẩn.
a: nồng độ (µg/mL) của dung dịch chuẩn PRC hoặc CPM, B1 thêm vào mẫu (đã biết).
- Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
n n 2 2 i i i=1 i=1 -μ -C S = = k k C C (2.5)
RSD = .100(%)
C S
(2.6) Trong đó: Ci là các giá trị nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC hoặc CPM, B1 tính được lần thứ i.
là giá trị nồng độ thực của mẫu.
C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định. k là số bậc tự do.
2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê
Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo cơng thức:
P,k
t .S
X ± ε = X ±
n (2.7)
Với tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 5 = 2,57 ); X là giá trị trung bình của tập số liệu các kết quả nghiên cứu; S là độ lệch chuẩn, được tính theo cơng thức (2.5); n là số phép đo.
2.4. Thiết bị , dụng cụ và hoá chất
2.4.1. Thiết bị
- Máy đo phổ UV-VIS Spectrophotometer UV-1700-SHIMADZU (Nhật Bản) có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190 - 1100 nm, có kết nối máy tính.
- Bộ cuvét thạch anh.
- Cân điện tử có độ chính xác đạt 0,1mg; Máy đo pH; Bếp cách thuỷ; Máy cất nước.
2.4.2. Dụng cụ
- Các dụng cụ thủy tinh cần thiết như: bình định mức, pipet, phễu, lọ đựng hóa chất, ống nghiệm, cốc thuỷ tinh...
- Chương trình lọc Kalman tính tốn đồng thời nồng độ các cấu tử [9,15]. - Một số dụng cụ khác.
2.4.3. Hóa chất
Chất chuẩn paracetamol và clopheninamin maleat , vitamin B1 đạt tiêu chuẩn dược dụng Việt Nam do Viện kiểm nghiệm dược sản xuất.
Các hóa chất: HCl, H2SO4, HNO3, CH3COOH, NaOH, KH2PO4, Na2HPO4., CH3COONa, Na2B4O7, NH4Cl ... dùng để pha chế các dung dịch đều thuộc loại tinh khiết của Merck.
Nguyên liệu phân tích:
- Thuốc viên paracetamol FB do cơng ty dược Hậu Giang sản xuất.
Chuẩn bị các dung dịch
- Dung dịch HCl 0,1M, 0,01M, 0,001M - Dung dịch H2SO4 0,1M, 0,01M, 0,001M - Dung dịch HNO3 0,1M, 0,01M, 0,001M
Cách pha chế các dung dịch trên:
Lấy 4,1 mL dung dịch HCl 37% (d = 1,18) đem pha loãng bằng nước cất 2 lần và định mức thành 50mL thu được dung dịch HCl 1M (pH = 0). Sau đó pha thành HCl 0,1M; 0,01M và 0,001M.
Lấy 2,7 mL dung dịch H2SO4 98% (d = 1,84) đem pha loãng bằng nước cất 2 lần và định mức thành 50mL thu được dung dịch H2SO4 1M (pH = 0). Sau đó pha thành H2SO4 0,05M; 0,005M và 0,0005M.
Lấy 3,5 mL dung dịch HNO3 65% (d = 1,39) đem pha loãng bằng nước cất 2 lần và định mức thành 50mL thu được dung dịch HNO3 1M (pH = 0). Sau đó pha thành HNO3 0,1M; 0,01M và 0,001M.
Các dung dịch này đều được xác định lại nồng độ bằng phương pháp chuẩn độ.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn PRC, CPM và B1
Cân chính xác một lượng 0,0250 g PRC, CPM và B1 hịa tan hồn toàn và định mức thành 50 mL được dung dịch có nồng độ 500 µg/mL. Từ dung dịch gốc có nồng độ 500 µg/mL tiến hành pha các dung dịch có nồng độ cần thiết cho các phép đo quang. Dung dịch được pha chế hàng ngày trước khi đo quang.