Schisantherin D phân lập từ cây Schisandra viridis có tác dụng ức chế virus HIV in vitro đối với tế bào bạch huyết H9. Schisantherin D thể hiện hoạt tính anti-HIV mạnh với giá trị EC50= 0,5g/ml và hệ số trị liệu (TI) 50,6 [14]; Hai hợp chất rubrisandrin A-B phân lập từ quả của cây Schisandra rubriflora [38] ; ba hợp chất dibenzocyclooctadien lignan marlignan A-C được phân lập từ thân của cây Schisandra wilsoniana [11] với hai hợp chất tiegusanin A và tiegusanin G đã được phân lập từ cây Schisandra propinqua var sinensis đều
có hoạt tính anti- HIV-1, tiegusanin G có hoạt tính anti-HIV-1 với EC 50= 7,9
g/ml, chỉ số điều trị (TI) lớn hơn 25 [26].
Schisantherin D Rubrisandrin A Rubrisandrin B
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tiegusanin A Tiegusanin G
Ngoài ra, từ dịch chiết cồn của quả cây Schisandra chinensis người ta
cũng đã phân lập được các neolignan. Các hợp chất neolignan này được kiểm tra khả năng chống khối u in vitro, ức chế kháng nguyên virus Epstein-Barr
(EBV-EA) trên dòng tế bào Raji. Kết quả cho thấy tất cả các chất đều có khả năng ức chế EBV-EA mà không gây độc trên dòng tế bào Raji. Trong đó hợp
chất schisandrin C có hoạt tính [37]; Dịch chiết từ quả Schisandra chinensis
còn có tác dụng ức chế sự chuyển hóa acyl cholesterol trên gan thỏ và người ta đã phát hiện hợp chất gomisin N được phân lập từ loài này có khả năng ức chế ACAT trên gan thỏ với giá trị IC50=25M; schisanhenol được phân lập từ một số loài thực vật Schisandra chinensis và Schisandra rubriflora có hoạt tính chống oxy hóa, chống peroxy hóa lipit [4].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hai hợp chất taiwanschirin C và schizarin A được phân lập từ cây
Schizandrarisanensis gây độc tế bào chống lại ung thư gan hepatoma (Hepa- 3B, ED 50= 2,2 g /ml với taiwanschirin C và ED 50= 4.2 g /ml với schizarin A) . Hợp chất schizarin A còn cho thấy hoạt tính chống lại ung thư ruột kết (Colo-205, ED 50= 2,9 g /ml) [61].
Taiwanschirin C Schizarin A
Bốn C19 khung homolignan 5,4’-butano-2,4-cyclohexadienone-6-spiro- 3’-(2’,3’-dihydrobenzo[b]furan); schiarisanrin A-C và schiarisanrin C, phân lập từ cây Schizandra arisanensis có hoạt tính gây độc tế bào tương ứng với ED50 =0,36; 7,1; 4,9 và 5,7 μg/ml, chống lại ung thư vòm họng (NPC), ung thư ruột kết (Colo-250), ung thư gan (HEPA hepatoma) và các tế bào ung thư cổ tử cung (Hela) [62].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu
Nguyên liệu để nghiên cứu là cây Ngũ vị tử nam. Mẫu tươi được thu hái vào tháng 08/2011 tại Dak Glei, Kon Tum.
Mẫu cây đem nghiên cứu hoá thực vật được ThS. Bùi Văn Thanh, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học là Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils., thuộc họ Ngũ
vị (Schisandraceae).
Hình 2.1. Cây và quả Ngũ vị tử nam Hình 2.2. Hoa Ngũ vị tử nam
Mẫu thân cành tươi (18kg) được khử men trong tủ sấy 10 phút ở nhiệt độ 110 oC, sau đó được sấy khô đến khối lượng không đổi (độ ẩm < 10%) ở nhiệt độ 60 oC thu được (4,5kg) mẫu khô.
2.1.2. Phương pháp ngâm chiết và phân lập các hợp chất từ dịch chiết
Mẫu khô (4,5kg) đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng trong thiết bị siêu âm cho đến khi nhạt màu (5 x 6l = 30l
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
metanol). Các dịch chiết gom lại và làm khô bằng natri sunfat (Na2SO4) khan. Sau khi lọc qua giấy lọc, dịch chiết thu được được cất loại dung môi bằng máy cất quay (T < 50 0C) dưới áp suất giảm, cặn chiết thu được đem chiết phân đoạn lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, etyl axetat). Sau đó, đuổi kiệt dung môi và chiết lại cặn còn lại bằng metanol, thu được 3 cặn tương ứng lần lượt là n–hexan (SSH), etylaxetat (SSE) và metanol (SSM).
Để phân lập các chất sạch từ hỗn hợp các chất có trong từng loại cặn dịch chiết, các phương pháp sắc ký (Sắc ký lớp mỏng (SKLM), Sắc ký cột thường Silica gel Merck 63-200 nm, với các dung môi và hệ dung môi thích hợp) đã được sử dụng phối hợp cùng các phương pháp kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.
Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm.
2.1.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các chất phân lập được
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, thời gian lưu Rf, điểm nóng chảy (0C), đo độ quang hoạt (αD) v.v.. Sau đó, tiến hành ghi các phổ tử ngoại (UV-VIS), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều proton (1
H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), phổ DEPT, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC và HMBC với các kỹ thuật khác nhau tuỳ theo đối tượng cụ thể. Các số liệu hóa lý thực nghiệm của các chất sạch được dùng xác định cấu trúc hoá học của chúng.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ, hoá chất
Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế sử dụng loại tinh khiết phân tích (p.a).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thước khác nhau đã dùng loại silicagel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hóa ở nhiệt độ 120 0C thời gian từ 6 giờ đến 8 giờ. Sắc ký lớp mỏng đế nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2 mm (Art. 5554).
Các hệ dung môi triển khai SKLM:
STT Hệ dung môi (Tỉ lệ thể tích) Kí hiệu 1 n-Hexan - EtOAc (8 : 1) hệ A 2 n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ B 3 n-Hexan - EtOAc (2 : 1) hệ C 4 Clorofom - metanol (9 : 1) hệ D 5 Clorofom - metanol (3 : 1) hệ E
Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254), sau đó phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100 oC, để phát hiện các hợp chất.
Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C, D, E)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70-230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm).
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200.
Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) dưới dạng viên nén KBr.
trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD.
Phổ 1
H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây Ngũ vị tử nam
2.3.1. Thu nhận các dịch chiết
Mẫu thân, cành cây tươi mới thu hái được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Dịch chiết được cất loại dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ thấp và áp suất giảm. Cặn dịch chiết metanol được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat, metanol và thu được các cặn chiết tương ứng, sau khi đuổi hết dung môi cho các cặn tương ứng là SSH (cặn n-hexan), SSE (cặn EtOAc) và SSM (cặn metanol). Việc thu nhận các dịch chiết từ cây Ngũ vị tử nam (Schisandra sphenanthera) theo sơ đồ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4 , lọc qua giấy lọc rồi cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân đến khối lượng không đổi. Như vậy, từ cây Schisandra sphenanthera thu được 3 loại cặn chiết được ký hiệu lần lượt là: SSH, SSE và SSM.
Ở đó: SSH: Cặn chiết n-Hexan của cây Schisandra sphenanthera
SSE: Cặn chiết EtOAc của cây Schisandra sphenanthera SSM: Cặn chiết MeOH của cây Schisandra sphenanthera
Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Ngũ vị tử nam ở Dak Glei, Kon Tum được nêu trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ cây
Schisandra sphenanthera Mẫu thu vào tháng 03/2011 Khối lượng mẫu khô (g) Khối lượng cặn metanol tổng (g)
Khối lượng cặn chiết thu được (g) từ 468,6 g cặn
MeOH đem chiết n-hexan EtOAc MeOH Thân, cành 4500 468,6 78,3 ( SSH) 104,3 ( SSE) 234,1 (SSM) 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% đun cách thủy đến khô. Hoà tan cặn trong 3 ml clorofom - lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1 ml anhydric axetic + 1 ml cloroform để lạnh ở 0 0C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1 ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit
Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit.
Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dương tính.
Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff , nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính.
2.3.2.3. Phát hiện các flavonoit
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit.
2.3.2.4. Phát hiện các cumarin
Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống
nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi cho thêm 4 ml nước cất vào mỗi ống. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính.
Ngoài ra, có thể làm phản ứng diazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dương tính đối với cumarin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.2.5. Định tính các glucosit tim
Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1.
Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt
dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính với vòng butenolit.
Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%
Cách tiến hành: Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm
vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim.
2.3.2.6. Định tính các saponin
Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho
2ml dịch thử. Ống 1 cho 1 ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính.
2.3.2.7. Định tính các tanin
Cân lấy 0,01g cặn chiết, thêm 10ml metanol nước cất, khuấy đều rồi nhỏ 2-3 giọt FeCl3 5%, nếu có màu xanh hoặc lục hoặc đen là phản ứng dương tính.
Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây Schisandra sphenanthera, được nêu trong bảng 2.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.2. Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Schisandra sphenanthera
STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tượng
Cặn tổng 1 Sterol Lieberman- Bourchardt Màu xanh Màu vàng +
2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam _
3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt _ H2SO4 đặc Hồng nhạt _ NaOH đặc Vàng _ FeCl3 5% Xanh thẫm _
4 Cumarin Phản ứng tạo kết tủa
bông Có kết tủa _
5 Glucosit trợ tim
FeCl3 trong
CH3COOH +H2SO4đ Vàng nâu rõ _ 6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH +
7 Tanin FeCl3 Màu xanh +
Chú giải : + : Phản ứng dương tính ─ : Phản ứng âm tính
2.4. Phân lập và tinh chế các chất
2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan của cây Ngũ vị tử nam (SSH)
Dịch chiết n-hexan làm khan bằng Na2SO4, sau đó cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 35,4g bột thô. Lấy 24,2g cặn chiết n-hexan đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan, n-hexan-etyl axetat, etyl axetat (0-100% EtOAc), và metanol thu các phân đoạn từ sắc ký cột ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra các phân đoạn thu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
được bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5%, sau đó các phân đoạn giống nhau được gộp lại rồi đuổi kiệt dung môi.
2.4.1.1. Hợp chất β-sitosterol (SSH1)
Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan - etyl axetat (20:1), thu được khối chất rắn vô định hình, kết tinh lại trong n-hexan đã thu được tinh thể hình kim không màu (68 mg), điểm chảy 138-140 0C.
Phổ ESI-MS (m/z): 414 [M]+.
Phổ IR (νmax , cm-1): 3431,5 (dao động hóa trị OH), 2931,3 (dao động hóa trị CH); 1647,2 (C=C). Phổ 1 H-NMR (500M Hz, CDCl3) δ (ppm): 3,51 (1H, m, H-3); 5,31 (1H, dd, J = 5; 2 Hz, H-6); 1,01 (3H, s, H-18); 0,92 (3H, d, J = 6,6 Hz, H- 21); 0,85 (3H, d, J = 7,1 Hz, H-26); 0,84 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-28); 0,68 (3H, s, H-19). Phổ 13 C-NMR (125M Hz, CDCl3) δ (ppm): 37,3 (C-1); 31,7 (C-2); 71,8 (C-3); 42,3 (C-4); 140,8 (C-5); 121,7 (C-6); 31,9 (C-7); 31,9 (C-8); 50,2 (C- 9); 36,5 (C-10); 21,1 (C-11); 39,8 (C-12); 42,3 (C-13); 56,8 (C-14); 24,3 (C- 15); 28,3 (C-16); 56,1 (C-17); 11,9 (C-18); 19,4 (C-19); 36,2 (C-20); 18,8 (C- 21); 33,9 (C-22); 26,1 (C-23); 45,9 (C-24); 29,2 (C-25); 19,1 (C-26); 19,4 (C- 27); 23,1 (C-28); 11,9 (C-29). 2.4.1.2. Hợp chất 1-linoleoylglycerol (SSH2)
Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan-etyl axetat (15:1), thu được chất vô định hình, kết tinh lại trong dung môi clorofom thu được chất bột màu trắng (57mg), điểm nóng chảy là 85-86 0
C, RfB= 70.
Thủy phân este hóa chất SSH2: Lấy 20mg chất SSH2 thủy phân trong dung môi metanol (30 ml) với sự có mặt của dung dịch HCl 1N (2 ml), hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu 6h, Sau khi phản ứng kết thúc thêm 70ml nước cất và chiết bằng n-hexan (3x20 ml). Dịch chiết n-hexan được làm khô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bằng Na2SO4 khan và đuổi hết dung môi thu được 11mg cặn. Sau khi chạy qua thiết bị GC có so sánh với các phổ đồ của chất chuẩn cho biết thành phần chính là metyl linoleat. Do vậy, có thể khẳng định phần axit của SSH2 chính là axit linoleic. Phổ thủy phân este hóa hợp chất SSH2 xem hình 3.3.1.
Phổ IR: ν (cm-1
), 3435 (OH), 1684 (C=O), 1028-1227 (C-O-C, este). Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): Phần axit: 0,88 (3H, t, J=7Hz, H-18); 1,28 (s broad, CH2); 2,35 (2H, t J=7,5Hz, H-2); 1,64 (2H, m, H-3); 2,02 (6H, m, H-8,11,14); 5,35 (4H, m, H-9,10,12,13); Phần glycerin: 4,20 (2H, m, H-1); 3,94 (1H, m, H-2), 3,69 (1H, m, H-3). Phổ 13 C-NMR (125MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): Phần axit: 174,34 (C- 1); 35,94 (C-2); 24,94 (C-3); 31.55-34,18 (C-8,11,17,20,16); 25,55-29,79 (CH2); 129,76-130,04 (C-9,10,12,13); 14,11 (CH3) Phần glycerin: 65,21 (C-