2.2.1 Phân lập, sàng lọc, tuyển chọn sơ bộ các chủng vi khuẩn có khả năng hấp thụ kim loại nặng.
2.2.1.1 Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt bố trí các bước thí nghiệm vi sinh
Phương pháp lấy mẫu
Mẫu nước thải được lấy từ bể thu gom của nhà máy thuộc da, công ty 190, đầu ra của nhà máy thuộc da, nước rỉ rác mới và cũ tại hố thu gom nước rỉ rác của bãi rác Tân Hiệp; Mẫu đất của nhà máy thuộc da, mẫu đất của công ty 190. Mẫu được khuấy đều trước khi lấy và được đựng trong chai nhựa 500ml đã được rửa sạch và đưa về phòng thí nghiệm. Sau đó tiến hành ngay các bước phân lập trong vòng 24 giờ.
Phương pháp phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng VK có khả năng hấp thụ Chromium
• Phương pháp tăng sinh
Tăng sinh trên môi trường Tryptic Soy Broth (TSB) có nguồn C là casein peptone và chứa các thành phần dinh dưỡng: Soya peptone, Sodium chloride,… là một trong những môi trường đặc trưng cho quá trìnhtăng sinh khối của VSV.Cần chỉnh pH của môi trường về trung tính trước khi sử dụng để thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật.
Lần lượt bổ sung vào môi trường trên các kim loại nặng: Cr6+, Zn2+, Cu2+, Cd2+, và Pb2+ với nồng độ 0,5mM. Sau đó, môi trường có bổ sung kim loại nặng này được phân phối vào các erlen( 15 – 20ml), có nút bông và được bọc bởi một lớp nhựa, hấp khử trùng ở 1210C/15 phút.
Mẫu lấy về được tiến hành cấy trực tiếp vào chai chứa môi trường TSB có chứa kim loại nặng đã được khử trùng ( đối với mẫu nước thải thì lấy 1ml, mẫu đất lấy 1g) trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm. Tăng sinh bằng cách lắc những chai môi trường đã được cấy mẫu ở tốc độ 170 vòng/phút trong vòng 24h.
Dấu hiệu nhận biết sự phát triển của VK có khả năng chịu được sự tồn tại của hàm lượng kim loại nặng trong môi trường là môi trường đục, có sinh khối.
Từ những chai môi trường đục ở trên, ta tiến hành pha loãng mẫu bằng nước muối sinh lý (0,85%) ở độ pha loãng 10-2, sau đó cấy 1ml mẫu và trang trên môi trường thạch Luria – Bertani (LB) (agar 1,8% - 2%) có bổ sung các ion kim loại nặng: Cu2+, Cr6+, Cd2+, Zn2+ và Pb2+ tại nồng độ 0,34 mM.
Ủ ở 370C trong 1 – 2 ngày. Quan sát đặc điểm các khuẩn lạc và tiến hành cấy ria nhiều lần các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường LB thạch cho đến khi thu được các chủng VK thuần khiết.
Tiến hành giữ giống trên môi trường LB thạch nghiêng.
Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng phân lập được từ môi trường có bổ sung ion Cr6+
• Nhuộm Gram
Ý nghĩa của quá trình này là nhằm phân biệt các loài VK phân lập được dựa trên các đặc tính hóa lý của thành tế bào (sự bắt màu của thành tế bào với thuốc nhuộm).
Quy trình nhuộm Gram được tiến hành như sau: Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm trên lam.
Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn.
Dùng crystal violet nhuộm mẫu trong 1 phút. Rửa bằng nước cất tối đa 5 giây.
Tiếp tục nhuộm mẫu bằng dung dịch lugol (1% iot, 2% KI) trong 30 giây.
Rửa bằng cồn 960 trong 20 giây, và tiếp tục rửa bằng nước cất trong 20 giây (thao tác này nhằm rửa sạch thuốc nhuộm crystal violet không gắn kết, VK Gram dương giữ lại màu tím, còn VK Gram âm mất màu).
Nhuộm tiếp với fuchsin trong 1 phút. Lúc này cả hai nhóm VK đều bắt giữ màu thuốc nhuộm, nhưng VK Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi đó VK Gram âm trở nên đỏ tía.
Rửa bằng nước cất, để khô và sau đó quan sát dưới kính hiển vi.
Cơ chế: VK Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi lớp peptidoglycan, chất này có khả năng giữ phức hợp crystal violet. Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các VK Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài.
Sau khi nhuộm với crystal violet , mẫu được xử lý tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp crystal violet bên trong tế bào.
Đối với VK Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hòa tan lipit và làm tan màng ngoài của thành tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp crystal violet và tế bào Gram âm bị khử màu (khâu này quan trọng vì có liên quan đến khả năng bắt màu của thành tế bào và kỹ năng của người nhuộm).
Đánh giá khả năng chịu Chromium của 13 chủng phân lập được
Tăng sinh 13 chủng phân lập được bằng cách pha 150ml môi trường LB (không bổ sung Cr6+) và được phối đều vào 14 chai thủy tinh (10ml/chai), đậy bằng nút bông, tiến hành hấp khử trùng ở 1210C/15 phút. Để nguội môi trường, tiến hành cấy sinh khối VK từ ống nghiệm thạch nghiêng giữ giống vào những chai môi trường trên (1 chủng/chai) bằng que cấy vòng và được tiến hành trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm
lắc 170 vòng/24h. Sau 24h tiến hành đo OD ở bước sóng 600nm, xác định mật độ của VK.
Pha 300ml môi trường LB và được phân phối đều vào các chai thủy tinh (20ml/chai),các chai được bổ sung kim loại nặng lần lượt ở các nồng độ: 0mg/l, 50mg/l, 100mg/l, 150mg/l, 200mg/l, 250mg/l, 300mg/l, 400mg/l, 500mg/l, 600mg/l, 700mg/l, 800mg/l, 900mg/l và 1000mg/l, có nút bông, được hấp khử trùng ở 1210C/15 phút. Sau đó tiến hành cấy VK đã được tăng sinh vào các chai môi trường trên sao cho đạt được mật độ 108cfu/ml. Ủ trên máy lắc trong 24h với tốc độ 170 vòng/phút.
Sau 24h tiến hành đo OD ở bước sóng 600nm, xác định mật độ VK tại mỗi nồng độ Cr6+.
Đánh giá khả năng loại bỏ Cr6+ của13 chủng VK phân lập được.
• Lập phương trình đường chuẩn Chrome.
Vì khảo sát khả năng hấp thụ Cr6+ của các chủng phân lập được trong môi trường dinh dưỡng LB, nên khi lập phương trình đường chuẩn Chromium cũng được tiến hành trên môi trường LB. Phương trình đường chuẩn được tiến hành dựa trên bảng số liệu sau (sử dụng bình định mức 100ml):
Bảng 2.1 Phương pháp lập đường chuẩn Chromium.
STT ĐC 1 2 3 4 5 6 VCr6+ tiêu chuẩn (ml) 0 0,5 1 2 3 4 5 VLB (ml) 10 10 10 10 10 10 10 Vnước cất (ml) 40 40 40 40 40 40 40 VH3PO4(dd B) (ml) 2 2 2 2 2 2 2 V1,5-diphenylcacbazide (ml) 2 2 2 2 2 2 2 C (mg/l) 0 0,025 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Định mức lên đến vạch, lắc đều và để yên 5 – 15 phút. Sau đó tiến hành đo độ hấp thụ mẫu ở
OD ? ? ? ? ? ? ?
Tiến hành tăng sinh các chủng VK trong erlen chứa 10ml môi trường LB không bổ sung Cr6+.Ủ trên máy lắc trong 24h với tốc độ lắc 170 vòng/phút. Sau 24h tiến hành đo OD ở bước sóng 600nm.
Pha môi trường LB phối vào các chai môi trường (50ml/chai) có bổ sung Cr6+ với nồng độ 200mg/l; môi trường trên được hấp khử trùng ở 1210C/15 phút. Dịch tăng sinh ta tiến hành pha loãng sao cho khi cấy vào môi trường đạt mật độ 108cfu/ml, trong đó đối với nghiệm thức đối chứng không bổ sung VSV. Sau đó tiến hành khảo sát tại các thời điểm: 0h, 12h, 24h, 48h, 72h và 96h.
Mẫu sau khi lấy tại các thời điểm khảo sát được đem đi phân tích hàm lượng Cr6+ còn lại. Tiến trình xác định nồng độ Cr6+ có trong mẫu được thực hiện theo bảng sau (sử dụng bình định mức 100 ml):
Bảng 2.2 Phương pháp định lượng Chromium.
Hóa chất Số thứ tự
0 1 2 … 11
Vmẫu (ml) 0 a a … a
Vnước cất (ml) 40 40-a 40-a … 40-a
VH3PO4 (ml) 2 2 2 … 2
V1,5-diphenylcacbazid (ml) 2 2 2 … 2
Định mức đến vạch → lắc đều, để yên 5 – 15 phút. Tiến hành đo ở bước sóng 540nm.
OD ? ? ? … ?
Mẫu được cho vào falcone và tiến hành ly tâm với tốc độ 4000 vòng/15 phút, thu phần dịch nổi ở trên, loại bỏ sinh khối. Cho một ít huyền treo – Al(OH)3 vào phần dịch thu được, lắc đều và tiến hành lọc qua giấy lọc.
Do việc tính toán nồng độ Cr phụ thuộc vào đường chuẩn Chromium nên trước khi tiến hành định lượng Cr6+ có trong mẫu, cần tiến hành pha loãng mẫu bằng nước cất để nồng độ Cr6+ của mẫu thí nghiệm phải thuộc trong đường chuẩn. Tại mỗi nồng độ khảo sát ở trên, nồng độ Cr6+ trong các mẫu sẽ rất khác nhau nên độ pha loãng cũng sẽ khác nhau.
Phương pháp tính hiệu suất xử lý Cr6+ trong mô hình khảo sát khả năng loại bỏ Chromium theo thời gian
Các giá trị OD có được trong phương pháp định lượng Cr6+ được lần lượt được thay thế vào hệ số Y của các phương trình và đường chuẩn tương ứng, suy ra giá trị của hằng số X tương ứng. Sau đó hệ số X được nhân với hệ số pha loãng của mẫu ban đầu (nếu có), kết quả tính toán được là hàm lượng Cr6+ có trong mẫu cần xác định.
Từ phương trình đường chuẩn của Chromium :
Y = 0,811X + 0,001 (R2 = 0,999) → X = (Y – 0,001)/0,811* hệ số pha loãng. Các giá trị của X lần lượt thay vào công thức:
để tính hiệu suất hấp thụ
Chrome của các chủng VK đã phân lập được.
Định danh mẫu bằng phương pháp giải trình tự gen 16S
Ba chủng vi sinh được tuyển chọn, trước khi đi vào thí nghiệm tiếp theo được gởi mẫu tại Phòng xét nghiệm NK-BIOTEK ở 793/58 Trần Xuân Soạn, P.Tân Hưng, Q.7, TP. Hồ Chí Minh để định danh thông qua việc giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH.
Nước thải thuộc da
Khảo sát các thông số đầu vào: COD, Nito, Phospho, Chrom.
Nồng độ 108 cfu/ml Nồng độ 107 cfu/ml
Lấy mẫu và phân tích các chỉ tiêu COD, SS, Chromium tại các thời điểm: 24h, 12h, 8h và 6h.
Đánh giá hiệu quả xử lý của chủng vi sinh. Không bổ sung VSV Bổ sung VSV
ĐC
2.2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
Phương pháp lấy mẫu
Nước thải được lấy từ đầu ra của dòng thuộc, được chứa trong can nhựa 30 lít và đưa về phòng thí nghiệm để tiến hành quá trình chạy mô hình xử lý.
Công đoạn chuẩn bị
• Chủng vi sinh
Tiến hành trong sinh 3 chủng đã được chọn trong erlen có chứa 300 ml môi trường LB không bổ sung kim loại (Cr6+). Sau đó ủ trên máy lắc trong 24h, với tốc độ 170 vòng/phút.
Tiến hành xác định mật độ trung bình của ba chủng trên trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm tại bước sóng 600 nm, tính toán lượng vi sinh bổ sung vào mỗi bể thí nghiệm dựa theo công thức :
OD 1,02 109 V1= C V2
Trong đó:
OD: Mật độ quang đo được trung bình của 3 chủng VSV
V1: Thể tích trung bình của mỗi chủng cần bổ sung vào bể (ml). C: Nồng độ VSV cần đạt được trong mỗi bể thí nghiệm (cfu/ml). V2: Thể tích nước thải chứa trong bể thí nghiệm (ml).
• Bùn hoạt tính
Bùn hoạt tính dùng cho việc xử lý được lấy từ nhà máy XLNT tập trung KCN Tân Bình, bùn được lấy trực tiếp từ các bể SBR của nhà máy.
Bùn lấy từ các bể SBR của nhà máy được đem về phòng thí nghiệm và tiến hành xác định nồng độ bùn. Kết quả thu được:
Cb = 63370 (mg/l).
Bùn được cho vào mô hình với MLSS vào khoảng 2000 – 3000 mg/l, với thể tích bể V = 6 lít. Thể tích bùn cần lấy để hàm lượng bùn trong bể đạt 2500 mg/l là:
Vb = = = 0,237 (lít)
Nước thải sau khi được đem về phòng thí nghiệm, tiến hành kiểm tra các thông số: COD, SS, Chromium, Ptổng, Ntổng.
Phương pháp lấy mẫu và phân tích mẫu
Mẫu được lấy tại các thời điểm: 24h, 12h, 8h và 6h theo từng tải trọng, quá trình tăng tải dùng lại khi hiệu suất xử lý COD của mô hình thấp hơn 70%. Mẫu sau khi lấy sẽ tiến hành pha loãng mẫu (nếu có) và sau đó mẫu được phân tích các chỉ tiêu COD, SS và Chromium.
Vận hành mô hình xử lý
• Giai đoạn chạy thích nghi
Pha loãng nước thải tới nồng độ COD khoảng 750mg/l. Trộn nước thải với bùn nuôi cấy, chủng VSV nuôi cấy rồi cho vào mô hình thí nghiệm.
Kiểm tra và điều chỉnh pH của mô hình về khoảng 6.5 – 7.5 bằng NaOH ( hoặc H3PO4).
Thời gian sục khí và lắng trong vài ngày đầu tuần được chọn đủ lớn sao cho bùn được thích nghi và không bị trôi hết ra ngoài, sau đó giảm trong những ngày tiếp theo khi mà bùn đã được thích nghi và lắng tốt hơn.
Sau thời gian thích nghi, bể phản ứng được vận hành với chu kì ổn định, tại các tải trọng ổn định.
Quá trình chạy thích nghi kết thúc khi hiệu quả xử lý COD ổn định , đạt trên 80%.
• Giai đoạn xử lý
Quá trình xử lý được thực hiện theo mẻ (chạy tĩnh). Thực hiện thao tác lấy mẫu và phân tích các chỉ tiêu (COD, SS, Chrome) tại các thời điểm : 24h, 12h, 8h và 6h.
Thường xuyên kiểm tra độ pH trong bể, kịp thời điều chỉnh pH của bể về khoảng 6.5 – 7.5, pH thích ứng cho sự phát triển bình thường của VSV.
Kiểm tra lượng bùn trong bể thông qua đại lượng MLSS, nhận thấy MLSS < 2500 thì kịp thời bổ sung bùn vào bể để đạt đến đúng hàm lượng bùn yêu cầu ban đầu của đề tài.
Phương pháp phân tích chỉ tiêu và số liệu
Mỗi số liệu liên quan được tiến hành phân tích từ 1 đến 3 lần để thu được giá trị trung bình của những lần phân tích mẫu.
• Phân tích các chỉ tiêu.
Bảng 2.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
Chỉ tiêu Phương pháp phân tích
COD Đun kín với bicromat
Chrome (VI)
Quang phổ hấp phụ sử dụng 1,5 diphenylcacdazid (TCVN 6658 :2000).
SS Lọc, sấy
• Kết quả của các thông số trong mỗi lần đo được xử lý như sau :
Kiểm tra và loại bỏ các thông số thô ở mỗi lần đo.
Tính giá trị trung bình của các thông số đo sau khi đã loại bỏ các thông số thô. Giá trị trung bình được tính và được hiển thị trên đồ thị.
Tất cả các số liệu được xử lý và vẽ đều được thực hiện excel.
Xác định các thông số động học đối với nước thải thuộc da
Trong quá trình XLNT thì giai đoạn xử lý sinh học đóng vai trò then chốt để loại bỏ các yếu tố ô nhiễm hữu cơ luôn hiện diện trong nước thải, để nâng cao hiệu quả xử lý và giảm chi phí thiết kế thì việc xác định các thông số dộng học là rất quan trọng. Một trong những nguyên nhân khiến hiệu quả xử lý chưa đạt yêu cầu là do thiếu các nghiên
cứu cụ thể với loại nước cần xử lý. Đó là những nghiên cứu không đòi hỏi chi phí cao nhưng lại có ý nghĩa thực tiễn lớn trong việc nâng cao hiệu quả xử lý của hệ thống xử lý nước thải. Từ các nghiên cứu thực nghiệm, ta có thể xác định được các thông số động học cho các quá trình, làm cơ sở cho việc thiết kế các hệ thống xử lý trong thực tế. Việc xác định các thông số động học của nước thải thuộc da cũng không nằm ngoài những nguyên nhân trên.
Các thông số động học cần xác định bao gồm : + Ks : hằng số bán vận tốc, (mg/l).
+ k : tốc độ sử dụng cơ chất tối đa. + Y : hệ số sử dụng sản lượng tối đa. + kd : hệ số phân hủy nội bào, (ngày-1).
CHƯƠNG 3:
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
3.1 Kết quả phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng có khả năng hấp thụ kim loại nặng.
3.1.1 Phân lập vi khuẩn
Để không bỏ sót các VK có khả năng chịu được kim loại nặng, tất cả các erlen tăng sinh đều được sử dụng làm nguồn phân lập bằng cách cấy trangtrên môi trường phân lập Lauria Betan, ủ ấm ở 370C trong vòng 2 ngày. Có ít nhất 2 chủng VK trên 1 erlen. Các khuẩn lạc riêng lẻ được tiến hành cấy chuyền sang môi trường thạch mới một lần