Gồm các bước cơ bản sau:
Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể VSV ban đầu: hóa lỏng mẫu phân lập, pha loãng đến nồng độ cần thiết, tiến hành cấy mẫu trên môi trường đặc trưng, đểcó được chủng thuần có thể lập lại nhiều lần pha loãng đến khi khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường thạch đều đồng nhất.
Phân lập VSV thuần khiết: cấy chuyền nhiều lần đối với từng loại khuẩn lạc riêng rẽ, có thể tiến hành cấy ria hoặc cấy trang. Chủng thuần khi khuẩn lạc trên môi trường là cùng một loại duy nhất, có hình thái giống với khuẩn lạc ban đầu.
Mỗi khuẩn lạc đơn chỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống nhau trong quan sát dưới kính hiển vi. Khi thực hiện phải tuân thủ nghiêm túc các yêu cầu về thao tác vô trùng.
Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc: chọn các khuẩn lạc riêng lẻ trên môi trường thạch, sau đó pha loãng ở các nồng độ cần thiết bằng nước muối sinh lý vô trùng, tiến hành cấy trang đối với các nồng độ pha loãng. Ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp, quan sát nếu khuẩn lạc đồng nhất về màu sắc, hình dạng thì được giữ lại, ngược lại khuẩn lạc không thuần nhất thì loại bỏ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc đồng nghĩa với sự thuần khiết của giống.
Việc lựa chọn nguồn lấy mẫu cũng khá cần thiết, từ môi trường lấy mẫu đặc trưng ta có thể dễ dàng để phân lập chủng VSV mong muốn.
Sau quá trình làm thuần chủng VSV phân lập, các bước kế tiếp có thể là xác định hình thái VSV bằng các phương pháp như nhuộm gram, nhuộm bào tử, nhuộm tiêm
mao, nhuộm vỏ nhày,... Và thực hiện các thử nghiệm sinh hóa như: khảo sát khả năng chịu Chrome, khả năng hấp phụ Chrome,… từ đó chọn ra chủng cần phân lập.